沙門氏菌毒力島及Ⅲ型分泌系統研究進展

陳 俊，蔣文燦，2，譚 天，許凱迪，楊麗紅

沙門氏菌毒力島及Ⅲ型分泌系統研究進展

陳 俊1，蔣文燦1，2，譚 天1，許凱迪1，楊麗紅1

沙門氏菌(Salmonella)是寄生于人和動物腸道內的革蘭氏陰性桿菌，能引起人和動物多種不同臨床癥狀表現，為人類食物中毒主要病原菌之一。沙門氏菌的侵襲力與毒力島(pathogenicity island，PI)及其編碼的Ⅲ型分泌系統(Type Ⅲ secretion system，T3SS)直接相關。本文對沙門氏菌毒力島、T3SS組成、T3SS分泌及調控機制、T3SS與沙門氏菌致病性、應用研究等進行綜述，以期為深入研究提供參考。

沙門氏菌；毒力島；Ⅲ型分泌系統；T3SS

1 沙門氏菌毒力島

沙門氏菌染色體、質粒上成簇分布的編碼毒力相關基因的特定區域稱為沙門氏菌毒力島(Salmonellapathogenicity island，SPI)。目前，已知許多病原細菌，如大腸埃希氏菌、沙門氏菌、李氏桿菌、耶爾森菌、幽門螺桿菌、霍亂弧菌、節瘤擬桿菌、金黃色葡萄球菌等，都存在毒力島，而且一種病原細菌往往具有1個或多個毒力島。沙門氏菌已有5個毒力島研究得比較清楚，分別是SPI1、SPI2、SPI3、SPI4、SPI5。SPI在沙門氏菌入侵腸道上皮細胞過程中扮演重要角色[1]。近年研究人員對沙門氏菌的進一步研究發現了更多的毒力島，近期陸續報道在傷寒、鼠傷寒、丙型副傷寒等沙門氏菌中新鑒定出SPI6、SPI7、SPI8、SPI9、SPI10、SPI11、SPI12等[2]，進而增加了人們對沙門氏菌及其致病性的認知。

1.1 SPI1 SPI1全長約40 kb，遺傳性狀穩定，存在于所有沙門氏菌中。已從SPI1中鑒定出39個基因，但并非所有基因都是T3SS所必須，現在已經確定只有29個基因參與編碼T3SS。其中，基因inv、hil、org、spt、spa、sip、iag、iac、prg、sic編碼T3SS的調節子和分泌性效應蛋白。沙門氏菌T3SS的調節子和分泌性效應蛋白，與沙門氏菌對腸道上皮細胞的定植及侵襲力有關，并可導致巨噬細胞的壞死和炎癥反應[3]。其中分泌性效應蛋白參與沙門氏菌粘附于宿主細胞表面，并引起腸黏膜細胞上的肌動蛋白發生重排，從而有利于沙門氏菌內化。Tsuyoshi M等通過敲除鼠傷寒沙門氏菌SL1344菌株SPI1上的基因sipB和sipC發現該菌株體外溶血現象消失，證明sipB和sipC與沙門氏菌體外溶血有關[4]。位于SPI1邊緣的4個基因(sitA、sitB、sitC、sitE)編碼一個鐵攝入系統，對沙門氏菌T3SS的分泌有一定促進作用。SPI1與志賀氏菌毒力質粒上的sqa/mxi/ipa基因結構非常相似。Amit V等研究發現，沙門氏菌SPI1的24個基因表達，及與鞭毛和運動有關的17個基因表達，可被柚皮素抑制[5]。

1.2 SPI2 SPI2全長約40 kb，含40個基因，組成4個操縱子(ssa、ssr、ssc、sse)，其兩側分別是pyykF和valVtRNA基因。SPI2編碼的T3SS在結構和功能上同SPI1編碼的T3SS均有所區別。ssa編碼T3SS成分，ssr編碼T3SS調節子，ssc編碼T3SS分子伴侶，sse編碼T3SS效應蛋白。ssrA具有促進沙門氏菌在雞生殖系統的定殖作用[6]。SPI2控制沙門氏菌在吞噬細胞和上皮細胞內的復制，并可使沙門氏菌逃避巨噬細胞輔酶Ⅱ信賴的殺傷作用。用信號標簽誘變技術(signature-tagged mutagenesis, STM)誘變的都柏林沙門氏菌突變株所做的試驗表明，SPI2對犢牛全身性和腸道性沙門氏菌病的發生都有重要作用[7]。SPI2還編碼一個雙組分調節系統，該系統包括傳感蛋白SpiR-SsaA和應答調控蛋白SsrB[8]。其中，SpiR-SsaA具有2個跨膜區，共含920個氨基酸序列；SpiR屬于傳感蛋白激酶的一種。Vijaya KD等通過利用SPI2上ssaT (780 bp)和sseF (888 bp)2個基因與其它4個基因invA(284 bp)、floR(198 bp),、sulL(425 bp)、tetG(550 bp)建立了一套檢測沙門氏菌SPI2及其耐藥性的多重PCR[9]。

1.3 SPI3 SPI3全長約為17 kb，位于染色體82＇處的selCtRNA位點下游，含10個開放閱讀框，組成6個轉錄單位，其中mgtCB操縱子編碼高親和力Mg2+傳輸蛋白質和MgtC，可介導沙門氏菌在巨噬細胞和低Mg2+環境中存活。

1.4 SPI4 SPI4全長約25 kb，位于染色體92＇處，含有18個開放閱讀框(ORFs)，可能由1個操縱子組成。編碼介導毒素分泌的Ⅰ型分泌系統，并參與調節沙門氏菌適應巨噬細胞內環境[10]，但其主要功能有待進一步研究。

1.5 SPI5 SPI5全長7 kb，位于沙門氏菌染色體25＇處，其兩側為serT和copS/copR位點，G+C含量約43.6%，包含sop、sig、pip共3個基因，負責編碼參與腸粘膜液體分泌和炎癥反應的相關蛋白，從而導致腸道液體的分泌和炎癥反應，并且受SPI1和SPI2編碼的蛋白所調控[11]。

1.6 SPI6 SPI6含有59個基因，首先在沙門氏菌亞種I中發現，其兩側分別為tRNAaspV基因和菌毛saf基因簇。實驗表明刪除鼠傷寒沙門氏菌整個SPI6對系統性發病機制沒有影響，但卻能使侵入人工培養細胞中的鼠傷寒沙門氏菌數量減少[12]。

1.7 SPI7 SPI7是傷寒沙門氏菌、都伯林沙門氏菌和甲型傷寒沙門氏菌的特有基因片段，長133 kb，毗鄰tRNApheU基因。SPI7編碼的重要毒力因子是Vi莢膜、SopE噬菌體和IVB菌毛。SPI7可能是通過水平轉移獲得，其基因組序列極為復雜。由于在SPI7中發現基因pil，tra和sam，因而SPI7被認為可能起源于接合質粒或接合轉座子。Pickard的一項研究顯示，SPI7中被稱為PAGI3的部分也出現在包括植物病原體地毯草黃單胞菌致病變種和銅綠假單胞菌及其他幾種細菌中[13]。Michael H對一株傷寒沙門氏菌分離株進行研究，并未觀察到Vi莢膜表型，說明SPI7基因不穩定[14]。噬菌體SopE也出現在缺失SPI7的腸炎沙門氏菌亞種I分離珠，表明噬菌體SopE可以被激活，并轉移sopE基因到其他分離株[15]。

1.8 SPI8 SPI8是在進一步研究腸炎沙門氏菌和傷寒沙門氏菌基因組序列時發現的。SPI8僅由6.8 kb組成，與tRNApheV基因相鄰[16]。編碼細菌素基因，但到目前為止沒有關于其功能的報道。

1.9 SPI9 SPI9僅16 281 bp，是沙門氏菌中發現較小的毒力島，位于傷寒沙門氏菌染色體中。SPI9編碼I型分泌系統和大型RTX樣蛋白，SPI9也出現在鼠傷寒沙門菌染色體中。

1.10 SPI10 SPI10大小為32.8 kb，位于tRNAleuX基因中，包含sefB、sefC和sefR基因，編碼Sef菌毛及引導伴侶蛋白調控菌毛操縱子[17]。Sef菌毛僅存在于傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌中，因而SPI10被認為是確定宿主特異性的一個因素。但到目前為止關于SPI10的研究還較少。

2 沙門氏菌Ⅲ型分泌系統

目前認為革蘭氏陰性致病菌在長期進化過程中形成入侵宿主細胞的特異性分泌系統共有5種類型(Ι～V型)，其中最顯著的便是細菌T3SS。對許多革蘭氏陰性致病菌來說T3SS是必不可少的，并且T3SS與鞭毛系統具有很高同源性，關于兩者之間的關系有許多猜測及驗證性報道，最近Vitold E G等研究發現沙門氏菌T3SS是從鞭毛系統演化而來的[18]。除沙門氏菌、大腸埃希氏菌、耶爾森菌、志賀氏菌等病原菌早已發現有T3SS外，近年研究發現銅綠假單胞菌、氣單胞菌、致病弧菌也存在T3SS[19]。

沙門氏菌的T3SS主要由SPI1和SPI2基因編碼產物組成，其功能主要表現在兩方面：其一，引導沙門氏菌的分泌蛋白轉運至宿主細胞并激活宿主細胞信號傳導通道，從而刺激宿主細胞產生細胞因子誘導巨噬細胞凋亡；其二，促使在沙門氏菌表面裝配侵襲小體。在沙門氏菌屬中，絕大部分沙門氏菌均只有一套T3SS，僅鼠傷寒沙門氏菌特有2套完全獨立的T3SS，可在感染的不同階段發揮相應作用：第一套T3SS主要參與入侵真核細胞，第二套則有利于侵入真核細胞后鼠傷寒沙門氏菌的生存[20]。近年在沙門氏菌T3SS組成、T3SS分泌及調控機制、T3SS與沙門氏菌致病性等研究方面取得了巨大進展。

2.1 沙門氏菌T3SS組成

2.1.1 T3SS組成蛋白 T3SS是由多組分蛋白組成的一個復合蛋白通道，所有的T3SS蛋白從功能上分成四類：菌膜裝置蛋白(Bacterial membrance apparatus proteins)、轉位子蛋白(Translocon proteins)、效應蛋白(Effector proteins)、T3SS分子伴侶(Type chaperones)。菌膜裝置蛋白橫跨細胞內、外膜，并延伸形成一個針狀結構(即注射裝置)通向胞外[21]。

轉位子蛋白在細菌細胞膜上形成一個小孔與注射裝置的針頭相對接方能使效應蛋白進入到宿主胞質中，缺少轉位子蛋白，效應蛋白則無法進入宿主細胞。效應蛋白在細菌致病過程中起關鍵作用，可引起宿主相應的病理變化，如修飾宿主細胞肌動蛋白細胞支架功能使其能進入非吞噬細胞內或黏附在上皮細胞表面，誘導感染的巨噬細胞凋亡等。

2.1.2 T3SS注射裝置 雖然各種細菌的T3SS在分泌功能上具有相似性，但在組織結構上卻各不相同。電子顯微鏡觀察顯示，沙門氏菌T3SS的分泌裝置是一個類似針頭形狀的超分子結構，現在通常將其稱為T3SS注射裝置[22]。T3SS注射裝置可以幫助沙門氏菌定植在宿主細胞的胞膜上并將沙門氏菌分泌的效應蛋白注入宿主細胞，該注射過程需要跨過3層膜(2層沙門氏菌胞膜和1層宿主胞膜)[23]。沙門氏菌T3SS注射裝置的核心是一個針頭狀的復合物：由一個圓柱形基座和一個針頭狀突起構成。基座是由分子量相同的3種蛋白組成的：InvG蛋白分泌家族的一部分組成底座的外環，PrgH/PrgK(具有脂蛋白的結構修飾單元)組成基座的內環[24]。T3SS由圓柱形基座固定在沙門氏菌表面，基座中貫穿有圓柱狀的連接針頭與基座的桿：桿狀結構由桿部結構蛋白PrgJ構成；針狀結構由針狀PrgI蛋白和調節針狀蛋白復合物裝配的InvJ蛋白組成。基座不僅可以幫助蛋白穿過細菌的內膜和外膜，而且和周質中的分泌結構有密切聯系。針頭狀突起是一個直的中空筒狀結構，長約60 nm，其內部有專門輸送分泌蛋白的狹窄中心孔道(約28?，2～ 3 nm)，孔道從底部的環狀結構一直延伸到針頭的頂端[25]。中心孔道非常小，折疊的蛋白要經過伸展后才能從中通過。針頭結構可以將細菌的效應蛋白直接注入宿主細胞。

2.1.3 T3SS分子伴侶 T3SS分泌蛋白，需要與細胞質中的附屬蛋白特異結合，這種附屬蛋白就稱為分子伴侶。分子伴侶相對分子量低(<20 000)、等電點低、二級結構以螺旋為主、通常是酸性。沙門氏菌T3SS分子伴侶缺少ATP結合位點和ATP水解活性。大多數情況下分子伴侶與特定的分泌蛋白相結合，也有的分子伴侶可以與多個分泌蛋白結合。這些分子伴侶與分泌蛋白N端的下游50～ 100氨基酸結合，分子伴侶使分泌蛋白在分泌前迅速伸展便于通過T3SS。將分泌蛋白呈遞給注射裝置后分子伴侶自己仍然留在細菌胞質中。另外，T3SS分子伴侶可促進相應底物分泌。T3SS分子伴侶和參與鞭毛組裝的分子伴侶很相似，過去認為T3SS分子伴侶從鞭毛伴侶進化而來，但現在有報道認為：它們擁有共同的祖先，但卻是各自獨立進化[26]。

目前在沙門氏菌T3SS發現的分子伴侶主要有：SicA、InvI、VnvH和OrgA。SicA可引導分泌蛋白進入轉位機制或阻止蛋白在分泌前降解。InvI的基因與InvJ及SpaQ相毗鄰，有人認為InvI可能是InvJ和SpaQ的分子伴侶。InvH具有使沙門氏菌粘附和侵入上皮細胞的能力，可能使沙門氏菌在內化前與宿主細胞發生黏附，起黏附素的作用。OrgA可能與沙門氏菌的入侵和蛋白分泌有關，同時參與對氧的調控。沙門氏菌分子伴侶在T3SS中發揮著重要作用，可與胞質中的效應分子結合，能將效應分子運輸到分泌裝置進行分泌，并對效應分子的構象形成有一定作用。T3SS分子伴侶結合相應的效應蛋白，保護相應的效應蛋白在胞質內不被降解，并有效地分泌、轉移效應蛋白。分子伴侶還能夠穩定細胞質內相應的底物，阻止相應底物與其他效應蛋白或轉位子蛋白未成熟前的同種或異種蛋白的結合，這種結合可能會導致結合蛋白的降解[27]。

2.2 T3SS分泌及調控機制 T3SS通常在沙門氏菌與宿主細胞接觸獲得激活信號才能啟動分泌。研究表明T3SS分泌信號位于沙門氏菌mRNA結構中，過去長期被認為是位于分泌蛋白的N端部分氨基酸。T3SS分泌蛋白時與分子伴侶結合是確保分泌前的穩定性和有效分泌的重要環節。沙門氏菌SPIl編碼的T3SS可釋放幾種效應蛋白刺激宿主細胞的信號轉導途徑，導致一系列的細胞反應，如肌動蛋白的變構從而導致細胞骨架的重排、轉錄因子的激活、離子通道的刺激，在某些細胞甚至會使細胞凋亡[28]。

沙門氏菌T3SS分泌和轉移過程是由非常復雜的轉錄機制和轉錄后機制調控的，此調控機制主要受到時間(生長階段)和空間(宿主細胞內外)的限制。例如，T3SS須獲得一個激活信號(來自于沙門氏菌mRNA結構)才能行使他的分泌功能。轉錄后調控機制是沙門氏菌在與宿主細胞相互接觸后才發揮功能的。沙門氏菌入侵基因表達的調控是由轉錄水平的幾個環境因素決定的，例如滲透壓、氧濃度或生長階段。目前，在分子水平僅發現DNA的超螺旋結構會影響蛋白的分泌；在蛋白水平，有兩個蛋白InvF(屬于轉錄激活子AraC家族)和HilA(屬于轉錄激活子OmpR/ ToxR家族，HilA又調節OrRA、SipC和InvF，這幾個蛋白最終形成一個調節莖環結構)參與沙門氏菌的入侵[29]。此外，沙門氏菌T3SS還受到幾個調控網絡的影響，如菌毛調控系統、PhoP/PhoQ調控系統[30]和OmpR/EnvZ調控系統及DNA結合蛋白HilD等。

2.3 T3SS與沙門氏菌致病性 沙門氏菌的致病性與其T3SS分泌的致病效應蛋白密切相關，在已知對動物致病的21種效應蛋白中，由沙門氏菌T3SS分泌的占到12種[31]。其中，沙門氏菌SPI1編碼的T3SS分泌8種：AvrA、SipA、SipC、SopB、SopD、SopE、SspH1、SotP；沙門氏菌SPI2編碼的T3SS分泌的4種：ExoS、ExoT、ExoV、ExoY；另外耶爾森氏菌占6種(YopA/O、YopE、YopH、YopJ/P、YopM、YopT)，志賀氏菌占2種(IpaA和IpaC)。用雞所做的試驗表明，由SPI2編碼的T3SS與雞沙門氏菌對雞的毒力有關。同時研究表明，缺失T3SS的鼠傷寒沙門氏菌不論感染途徑如何均不能引起全身性疾病。

3 應用研究

研究沙門氏菌毒力島及其編碼的T3SS對于了解沙門氏菌致病機制具有重要作用，因而現在越來越多的研究者對沙門氏菌毒力島及其編碼的T3SS表現出濃厚興趣，沙門氏菌毒力島及其編碼的T3SS已成為沙門氏菌研究的熱點之一。目前，在沙門氏菌中已鑒定出毒力島12個，是否還存在尚未發現的毒力島還有待進一步研究。王晶鈺等研究表明攜帶SPI1+SPI2與沙門氏菌的致病性呈正相關，并且SPI3可作為檢測沙門氏菌的毒力標志[32]。Taseen S D等通過評價腸炎沙門氏菌SPI1編碼的毒力蛋白作為預防禽類的疫苗具有良好的效果，因此他們認為將沙門氏菌SPI1編碼的蛋白與其它相關蛋白組合成亞單位疫苗來預防禽類腸炎沙門氏菌將具有廣泛的研究及應用前景[33]。Amanda LS等將腸炎沙門氏菌SPI2編碼的蛋白作為疫苗免疫試驗雞，通過測定發現雞卵黃IgG和血清IgG抗體水平明顯上升，表明將腸炎沙門氏菌SPI2編碼的蛋白作為疫苗免疫雞可以顯著提高雞體液免疫水平的作用[34]。因而，預計今后關于沙門氏菌SPI1及SPI2編碼的蛋白作為預防沙門氏菌的疫苗抗原的研究將會成為一個研究熱點。

近幾年來對于沙門氏菌T3SS在抗腫瘤方面的研究也取得了一定進展。Pawelek等[35]通過基因缺失突變實驗證明，鼠傷寒沙門氏菌SPI2編碼的Ⅲ型分泌系統對于沙門氏菌抗腫瘤效應至關重要，可使得沙門氏菌靶向至腫瘤并在瘤內增殖。敲除SPI1體外實驗發現可降低沙門氏菌的侵襲力100倍，但是體內實驗證明對于腫瘤生長卻并無抑制作用；然而，敲除SPI2即可消除腫瘤生長抑制現象。HiroyoshiNishlkawa等[36]通過構建鼠傷寒沙門氏菌疫苗株進行腫瘤消除實驗發現沙門氏菌T3SS可使腫瘤生長速度減慢，然后逐漸變小甚至消失，因而他們認為沙門氏菌T3SS產生的抗原在腫瘤疫苗方面很有研究前景。Klaus Panthel等[37]通過研究沙門氏菌T3SS的抗小鼠纖維瘤免疫力，得出相似結果。最新研究顯示減毒沙門氏菌通過T3SS可介導與宿主之間的反應，能傳遞效應基因并在細胞表面或胞漿中表達多種治療性蛋白，誘導機體產生相應的特異性體液免疫、細胞免疫及局部黏膜免疫反應，抵抗攜帶相應外源蛋白的病原體入侵。盡管減毒沙門氏菌在腫瘤基因治療上具有良好的基因傳遞載體優勢，但腫瘤基因治療目前還處于發展早期，在臨床應用中還存在許多困難：如何提高沙門氏菌作為兼性厭氧菌對乏氧組織的靶向定植特異性；如何減輕甚至消除沙門氏菌作為致病菌其內毒素及T3SS分泌的致病性效應蛋白可能存在引起機體部分機能甚至全身性疾病的潛在危害；如何將減毒沙門氏菌載體高效地轉移至機體腫瘤組織內部甚至進入處于靜止期的腫瘤細胞；如何提高減毒沙門氏菌T3SS分泌蛋白表達效率及能否將腫瘤基因治療與其他常規腫瘤治療方法聯合應用等，都是減毒沙門氏菌T3SS在腫瘤基因治療中存在的科學難題。即使面臨這些難題，腫瘤的基因治療在現代臨床醫學中仍擁有廣闊的發展前景，只要努力解決好存在的各種問題，今后減毒沙門氏菌必將在腫瘤的治療中發揮非常重要的作用。

對沙門氏菌毒力島及其編碼的T3SS的研究，有助于闡明沙門氏菌分子水平致病機制，對于發展腫瘤基因治療、開發腫瘤基因治療疫苗及研發抗革蘭氏陰性菌藥物具有重要意義。

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Salmonella pathogenicity island and type III secretion system

CHEN Jun1,JIANG Wen-can1,2,TAN Tian1,XU Kai-di1,YANG Li-hong1

(1.Animal Medicine College, Sichuan Agricultural University, Ya'an 625014, China;2.Sichuan Key Laboratory of Animal Disease and Human Health, Ya'an 625014, China)

Salmonellawas a gram-negative bacterium which parasitized in the intestinal of humans and animals, which could cause a variety of different clinical symptoms in human and animals, and being one of the main pathogens for human food toxicosis. The invasiveness ofSalmonellawas directly related to pathogenicity island (PI) and type Ⅲ secretion system (T3SS) encoded by PI. The research progress ofSalmonellapathogenicity island, the composing of T3SS, secretion and regulation mechanisms of T3SS, T3SS and salmonella pathogenicity, and application research was summarized in this paper, and with a view to providing reference for in-depth study.

Salmonella; pathogenicity island; type III secretion system; T3SS

Jiang Wen-can, Email: jiangwc1234@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.017

蔣文燦，Email：jiangwc1234@163.com

1.四川農業大學動物醫學院，雅安 625014； 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，雅安 625014

S855.1

A

1002-2694(2015)04-0371-06

2014-07-10；

2015-02-15

教育部長江學者和創新團隊發展計劃創新團隊項目(IRT0848)

Supported by the Program for Changjing Scholars and Innovative Research Team in University (No. IRT0848)