基于PD-1靶點的免疫診斷和治療策略①

王　芳　付　潔　宋海峰　(軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所藥理毒理研究室，北京100850)

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基于PD-1靶點的免疫診斷和治療策略①

王芳付潔宋海峰(軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所藥理毒理研究室，北京100850)

①本文為國家“十二五”重大專項(2012ZX09301003-001-007)、國家自然科學基金(81272701)。

腫瘤免疫治療已成為繼腫瘤手術、放療和化療同等重要的第四種腫瘤治療模式。基于對腫瘤生物學和免疫學原則的不斷深入研究，提高抗腫瘤細胞免疫功能、消除腫瘤細胞對免疫細胞抑制性因素，已發展為免疫治療的重要策略。細胞程序性死亡-1 (Programmed Death 1，PD-1)是近年來發現的負性刺激分子之一，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子大小為55 kD，屬于CD28型家族，作為抑制分子表達于活化的T細胞和B細胞表面。腫瘤細胞表面表達和分泌細胞程序性死亡配體-1(Programmed Death 1 Ligand，PD-L1)，PD-L1與腫瘤浸潤淋巴細胞表面的PD-1分子結合后，會抑制T、B淋巴細胞的活性，是腫瘤細胞逃避機體免疫的主要原因之一［1］。因此在腫瘤免疫治療中，基于PD-1為靶點的免疫治療藥物成為研發的熱點?，F就PD-1/PD-L1通路在免疫調節中的作用及其在免疫治療方面的研究進展進行綜述。

1　PD-1/PD-L1在免疫調節中的作用

1.1 PD-1/PD-L1與細胞免疫PD-1/PD-L1通路對T、B細胞免疫應答具有重要調控作用。1992年，Keir等［2］首次發現PD-1是T細胞激活、誘導外周耐受和維護耐受的主要調節器。PD-L1作為協同刺激分子與T細胞表面PD-1結合，通過抗原呈遞細胞(APC)單向信號傳送刺激，使T細胞受體信號途徑的分子如Zap70、磷脂酰肌醇-3激酶等酪氨酸殘基脫磷酸化，導致T細胞受體的信號傳導減弱，進而引發免疫功能無法正常執行［3］。同樣，PD-L1與B細胞表達的PD-1分子相互作用，協同BCR抑制下游信號途徑分子如syk、磷脂酰肌醇-3激酶、磷脂酶-3等酪氨酸殘基磷酸化，從而抑制B細胞激活［1］。此外，有研究表明，PD-1的敲除或封閉小鼠將引起自身免疫疾病［2］，如自發狼瘡樣綜合癥、亞急性Ⅰ型糖尿病或擴張型心肌?。?］。而PD-L1的缺失小鼠則失去了清除感染性病毒的能力［5］，并且在非造血細胞中，PD-L1的表達能抑制免疫介導的組織損傷［6］，這些數據提示PD-L1和PD-1的結合能夠維持外周淋巴細胞對自身抗原的免疫耐受，該負性調節作用是對自身免疫性疾病發生的一種自我防護。

1.2 PD-1/PD-L1與腫瘤免疫調節機體的免疫系統對變異細胞具有監視和清除的能力，癌變細胞表達的特異性抗原會被宿主T細胞識別，激活機體免疫活性抗擊癌細胞，然而免疫系統很難對腫瘤細胞進行大量清除。其原因為在腫瘤早期，癌細胞通過改變其表型逃脫免疫監控［8］，在腫瘤進展和轉移中腫瘤細胞表面高表達的PD-L1分子與T細胞表面的PD-1相結合，可選擇性抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖和活化，同時降低IL-10、INF-γ、IL-2的表達和分泌，下調細胞免疫功能，誘導細胞殺傷性T細胞凋亡，介導腫瘤免疫逃逸［9，10］。一些數據已證實PD-L1在腎細胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌等患者［11-16］體內高表達，并且高表達PD-L1的患者預后差。因此，PD-L1表達的高低也逐漸成為腫瘤患者的預后指標之一。同時PD-L1的表達對腫瘤起上調作用，通常誘導浸潤T細胞釋放干擾素-c(IFN-c)［17，18］，誘導T細胞高表達PD-1。此外，一些細胞因子或炎癥因子如IFN-γ、IL-4、脂多糖(LPS)等，對腫瘤微環境PD-L1也具有上調的功能，從而促進腫瘤的免疫逃逸。但是最近的研究發現，并非所有的腫瘤PD-L1的表達都具有預后不良［12，19］。對于轉移性黑色素瘤(MEL)病人，一般研究表明病變腫瘤浸潤淋巴細胞要比外周血或癌旁組織中PD-1的表達高。然而，Ahmadzadeh等［20］的研究顯示，PD-L1+MEL病人比PD-L1－MEL病人的存活率要長。研究者推測腫瘤浸潤淋巴細胞可能通過分泌細胞因子(如IFN-c)發揮抑制作用，進而驅動了腫瘤PD-L1的表達。

1.3 PD-1/PD-L1與慢性病毒感染慢性病毒感染的成因主要包括病毒迅速變異導致對機體的免疫逃避，以及人體內的特異性T細胞出現功能缺失而不能有效清除病毒。而慢性病毒感染導致T細胞耗竭的關鍵機制是由于PD-1/PD-L1通路對T細胞功能的重要調節。周筱英等［21］觀察105例慢性HBV病毒感染病人CD8+T細胞上PD-1的表達，發現55例免疫清除的患者比50例免疫耐受患者的CD8+T細胞表達量高(t= 18.08，P＜0.01)，但表達PD-1的CD8+T細胞少，PD-1 mRNA也在PBMC中表達低(t=30.89，P＜0.01)，說明PD-1/PD-L1通路在病毒的清除中存在一定的作用。為驗證阻斷PD-1/PDL1后免疫系統的變化，Liu等［22］體外抑制了肝炎病毒感染土撥鼠的PD-1/PD-L1通路，發現HBV特異性T細胞的功能得到了恢復，說明PD-1/PD-L1通路在慢性HBV病毒感染中，具有負性調控的作用。在HIV感染期間，病人B細胞和T細胞表面PD-1表達量明顯升高，并且B細胞和CD4+CD8+T細胞均無反應活性，當抗體封閉PD-1或使用RNAi手段干擾下調抑制性受體后，部分T細胞、B細胞恢復了活化增殖和產生抗HIV特異性抗體的能力［23］。同時為探討不同慢性病毒感染階段封閉PD-1是否具有上述同樣效果，Velu等［24］建立了獼猴感染慢性自身免疫缺陷病毒(SIV)的模型，在早期和晚期慢性感染中，封閉PD-1后，獼猴可快速表達病毒特異性CD8+T細胞，并引起記憶性B細胞增殖和分泌特異性SIV包膜抗體的增加，T細胞免疫反應得到增強，致使血液中SIV病毒載量明顯減少，從而延長了獼猴的壽命。研究說明在感染不同階段，阻斷PD-1受體，均可以達到一定的治療效果。此外，在Fuller等［25］模擬的獼猴感染HCV模型中有1/3的獼猴在接受PD-1抗體治療后HCV病毒顯著減少，無明顯肝細胞損害，并且與未進行PD-1抗體封閉獼猴相比，對記憶性B細胞增殖具有促進作用，這些數據證實了以PD-1為靶點的免疫治療的有效性。

1.4生物標志物PD-1/PD-L1通路除在免疫治療中具有重要作用外，抗PD-1抗體還可以作為癌癥診斷和預后的生物標志物發揮重要作用。Matsumoto等［26］對52例Ⅰ型自身免疫性肝炎(AIH)、24例肝損傷(DILI)、30例病毒性肝炎(AVH)、11例原發性硬化性膽管炎(PSC)和62名健康志愿者血清中抗-PD-1抗體進行檢測，其含量分別為63%、8%、13%、18%和3%。AIH患者血清中PD-1抗體含量明顯高于其他組，并且Ⅰ型AIH患者血清抗PD-1抗體含量的高低與血清中膽紅素(r=0.31，P=0.030)和丙氨酸氨基轉移酶相關(r= 0.31，P=0.027)。這些數據提示抗PD-1抗體將可作為AIH診斷的一個輔助檢測指標。為進一步驗證這一指標的可行性，Miyake等［27］檢測71例Ⅰ型AIH患者和37例DILI患者血清中抗PD-1抗體，結果表明Ⅰ型AIH患者比DILI患者(P＜0.001)抗PD-1抗體水平高，研究充分說明血清中抗PD-1抗體可作為Ⅰ型AIH輔助診斷的有用標志物。

2　抗PD-1抗體的研發進展

如上所述，抑制PD-1/PD-L1途徑可以部分恢復T細胞和B細胞的效應功能，提高抗腫瘤免疫應答，削弱腫瘤細胞的免疫抑制效應，證實了PD-1為T細胞的一個典型性抑制受體。此外T細胞表面還存在其他抑制受體，如(如細胞毒性T淋巴細胞抗原) CTLA-4，Nishimura等［28，29］的小鼠模型證實CTLA-4是集中參與和預防自身免疫性疾病發展的調節位點，而PD-1是防止自身組織損傷的慢性感染和炎癥反應的位點。隨著近年來對腫瘤免疫逃逸機制研究的深入，使用單克隆抗體藥物阻斷共刺激分子CTLA-4和PD-1通路，消除腫瘤細胞對T細胞的免疫抑制策略具有重要應用前景，并且大量抗體藥物在臨床研究中已取得了巨大進展［30］。抗CTLA-4單克隆抗體ipilimumab在晚期黑色素瘤的治療中率先取得歷史性突破，在臨床研究中首次改善了晚期黑色素瘤患者的總生存期，并于2011年被FDA批準用于治療轉移性黑色素瘤，同年被EMA批準用于治療復發的晚期黑色素瘤［31］。同樣，抗PD-1抗體藥物也取得了一定的成果，在臨床研究中抗PD-1抗體對多種實體瘤治療具有良好的療效，并且部分抗PD-1抗體藥物在藥物報批過程中也進展順利。

2.1抗PD-1抗體臨床研究進展目前有40多例在研的抗PD-1抗體藥物處于臨床研究階段，其中已有兩個抗體藥物率先獲批上市。施貴寶公司(BMS)的BMS-936558(Nivolumab)抗體，在2014年7月于日本獲得上市批準，是全球首個獲批的抗PD-1抗體藥物;同年9月默沙東公司(Merck)的抗PD-1抗體MK-3475(Lambrolizumab)，也經過FDA加速審批通道，成為在美國獲批的首個抗PD-1藥物。另外針對PD-L1靶點的兩個抗體藥物(羅氏和Medimmune公司)也已進入到臨床Ⅲ期的研究，預計到2017年上市。

Nivolumab是一個全人源的抗PD-1單克隆抗體，該藥在長期治療晚期實體瘤中具有良好的療效，對304例晚期實體瘤患者(127例非小細胞肺癌，107例黑色素瘤，34例腎細胞癌，19例結腸癌，17例前列腺癌)進行Nivolumab抗體治療，數據顯示ORR達到16%～33%，OS最高達到50%［32］。Topalian等［33］對Nivolumab在臨床前療效的評價顯示，203例腫瘤患者(給藥方案: 10 mg/Kg，間隔2周，給藥4 次)具有良好療效，非小細胞肺癌、惡性黑色素瘤、腎細胞癌患者的有效率分別為14%(14/76)、8% (26/94)、27%(9/33)。現在Nivolumab對膀胱癌、腎細胞癌、非小細胞肺癌和其他適應癥處于臨床Ⅲ期的研究，其上市針對的主要適應癥為黑色素瘤。

Lambrolizumab(MK-3475)是一種人源化IgG4的抗PD-1單克隆抗體。Lambrolizumab臨床Ⅰ期實驗對135例黑色素瘤患者(給藥方案: 10 mg/Kg，間隔2或3周，共6次)具有良好的療效，接受抗體治療后患者的免疫應答率為38%～52%，且免疫應答可維持11個月之久，并且這135例病人中有過半數量的病人腫瘤無進展期可達7個月［34］?，F在Lambrolizumab對非小細胞肺癌處于臨床Ⅲ期的研究，同時lambrolizumab與化療的Ⅱ期臨床試驗也正在進行中，其上市的適應癥同樣是針對黑色素瘤。

BMS公司的另一個抗體藥物BMS-936559是一種全人源的抗PD-L1單克隆抗體(能夠抑制PD-L1 與PD-1、CD80結合)，對207例進展性癌癥(75例非小細胞癌、55例黑色素瘤、18例結腸癌、17例腎細胞癌、17例卵巢癌、14例胰腺癌、7例胃癌、4例乳腺癌)患者進行標準化療后，接受6個療程抗體治療結果顯示有效率在6%～17%，并且12%～14%患者具有可長達24周的緩解［35］。

2.2抗PD-1抗體臨床研究安全性評價抗PD-1抗體治療癌癥在臨床研究階段取得了可觀的療效，然而Nivolumab和Lambrolizumab阻斷PD-1/PD-L1通路后，激活了效應T細胞功能，可引起機體對自身抗原的免疫反應，其所產生的不良反應目前主要有疲勞、輸液反應、腹瀉、關節痛、皮疹、惡心、瘙癢、頭痛等，此外還對肝功能和內分泌腺(包括垂體、甲狀腺、腎上腺和性腺)的功能有影響。

Nivolumab臨床Ⅰ期的安全性評估顯示，207例癌癥病人中引起皮疹(12%)，瘙癢癥(9%)，腹瀉(11%)，轉氨酶(3%～4%)，甲狀腺的變化(2%)，輸液反應(3%)，肺炎(3%)，3～4級(腹瀉、皮疹、甲狀腺異常等)不良反應(14%)。Lambrolizumab臨床Ⅰ期的安全性評估顯示，135例晚期黑色素瘤患者在治療中會引起輕微的臨床疲勞、瘙癢、腹瀉等臨床反應［34］。Nivolumab與Ipilimumab聯合治療的臨床Ⅰ期毒副安全評價結果顯示［36］，多達53%病人有3～4級臨床反應。單克隆PD-1抗體引起的不良反應多為輕度，并且多為劑量依賴，而聯合抗體治療引起的不良反應中有過半病人的不良反應較嚴重，因此進行聯合治療時的劑量可能更要嚴格把關。抗PD-L1抗體［36］引起的不良反應高達91%，但大部分為1～2級輕度不良反應，此外還引起輸液反應(10%)和3 ～4級不良反應(9%)。這些藥物引起的不良反應可能是由潛在的免疫反應所引起的，在接受了糖皮質激素類藥物治療后病人的不良反應可得到緩解，補償療法可以緩解由于病人接受抗體治療引起的內分泌失調，抗組胺劑、解熱劑、糖皮質激素類藥物可以改善病人的輸液反應。值得注意的是，抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體藥物的療效顯著，并且毒副作用與Ipilimumab相比更溫和，且耐受良好。因此抗PD-1抗體藥物在免疫治療的安全性評價上更具有優勢。

2.3抗PD-1抗體與其他藥物聯合治療基于PD-1通路的免疫治療和化療、放療以及針對其他靶點的免疫治療的聯合應用，可能在未來的疾病治療中更具有意義。Deng等［37］利用高劑量電離輻射(IR)與抗PD-L1抗體聯合治療小鼠乳腺癌，結果聯合治療降低了小鼠腫瘤浸潤髓源性抑制細胞(MDSCs)的局部聚集，減弱了對T細胞的抑制，活化了細胞毒性T細胞，改變了腫瘤免疫微環境。該實驗為IR、PD-1/PD-L1和T細胞之間的密切關系提供了依據，并且這種聯合治療方式也為后續合理的免疫調節與放療的聯合治療提供新的設計思路。在小鼠卵巢癌的研究中，Lu等［38］合并anti-PD-1和GITR(激活Tregs的功能標志物)抗體對建立的小鼠腹膜ID8卵巢癌模型進行治療，發現聯合治療比單獨單抗治療表現出更好的抗腫瘤效果，anti-PD-1和GITR抗體的聯合治療明顯促進了CD8+T細胞的增殖，增加了效應T細胞產生干擾素-γ的頻率，降低免疫調節性T細胞和髓樣抑制性細胞的數量，改變了小鼠膜腹腔內的腫瘤免疫抑制微環境，增強了免疫狀態。并且聯合化療藥物(順鉑或紫杉醇)治療后增強了小鼠抗癌抗菌素的產生，使80%的ID8卵巢癌小鼠腫瘤消失，延長了小鼠的存活期。此外，Zeng等［39］用轉染有熒光素的腦膠質瘤細胞建立的小鼠顱內膠質瘤模型，分別對單獨輻射、單抗PD-1抗體、聯合輻射和抗PD-1抗體三種治療方式進行研究比較，發現未接受治療組小鼠中位生存期為25 d，單獨PD-1抗體治療組中位生存期為27 d，輻射治療組為28 d，而聯合輻射和抗PD-1抗體治療組具有53 d中位生存期，研究說明聯合治療對腫瘤治療具有更好的療效。

此外一些非臨床數據［40-42］表明，PD-1與CTLA-4，PD-1與Tim3，PD-1與CD28等抗體聯合治療，對小鼠真菌敗血癥，慢性淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒感染，均可協同促進CD8+T細胞的增殖表達和病毒的控制，與單獨抗體治療相比，具有更好的療效。

4　展望

PD-1在調節T細胞免疫中發揮了重要的作用，是開啟免疫治療的有效靶點。由于許多腫瘤細胞表面會高表達PD-L1，因此PD-L1可能成為腫瘤發展中預測性的有效生物標志物。雖然PD-1/PD-L1通路及其調節機制仍未完全闡明，但是在臨床試驗階段，抗PD-1和PD-L1抗體治療已取得了一定的療效，相信隨著對免疫學的不斷深入研究，PD-L1/PD-1通路的調節機制會更加明確。此外，隨著對免疫抑制靶點的研究，在聯合治療藥物上，抗PD-1抗體藥物與放療、化療、電力輻射、造血干細胞移植等聯合治療將有巨大的臨床應用前景，從而有望對癌癥、慢性炎癥等患者產生持久的抗腫瘤效應。同時，抗體治療給患者帶來的一些臨床反應還需要在進一步臨床試驗中做嚴格的安全性評估。

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［收稿2014-06-05修回2015-04-01］

(編輯倪鵬)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．027

通訊作者及指導教師:宋海峰(1972年－)，男，博士，研究員，主要從事生物技術藥物藥理學等方面的研究，E-mail: bapklab@ yahoo．com。

作者簡介:王芳(1987年－)，女，主要從事抗體藥物藥效學評價的基礎和應用基礎研究，E-mail: fangfangfighting87 @ 163．com。

文章編號1000-484X(2015) 10-1413-05

文獻標志碼A

中圖分類號R392.11