P21活化激酶6在結腸癌組織中的表達及其意義

王飛，李建國，吳巧斌，鄧龍，羅杰，李再曄

（1.福建醫科大學附屬漳州市醫院普一科，福建 漳州 363000；2.福建省漳州正興醫院肝膽胰脾診療中心，福建 漳州 363000；3.中南大學湘雅醫學院，湖南 長沙 410013）

·論著·

P21活化激酶6在結腸癌組織中的表達及其意義

王飛1，李建國2，吳巧斌1，鄧龍1，羅杰1，李再曄3

（1.福建醫科大學附屬漳州市醫院普一科，福建 漳州 363000；2.福建省漳州正興醫院肝膽胰脾診療中心，福建 漳州 363000；3.中南大學湘雅醫學院，湖南 長沙 410013）

目的探討P21活化激酶6（PAK6）在結腸癌組織的表達水平及臨床意義。方法應用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time PCR/qPCR）檢測25例結腸癌患者腫瘤組織、配對的癌旁正常組織PAK6基因的mRNA表達水平，通過免疫組織化學的方法檢測94例結腸癌及其癌旁正常組織PAK6的蛋白表達水平，并結合臨床資料進行相關分析。結果qPCR顯示腫瘤組織中PAK6 mRNA的表達水平顯著高于癌旁正常組織（P＜0.01）。免疫組織化學顯示PAK6在正常組織低表達10.64%（10/94），在腫瘤組織中高表達64.89%（61/94）；PAK6的表達量與腫瘤AJCC分期、腫瘤分化、Ki67表達水平和腫瘤遠處轉移顯著相關（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析顯示PAK6陽性組患者5年無病生存率及總體生存率均明顯低于PAK6陰性組（P＜0.01）；多因素COX回歸模型分析發現PAK6高表達是影響結腸癌預后相關的獨立危險因素。結論PAK6在結腸癌組織中高表達，與腫瘤分期、分化及遠處轉移相關，可作為結腸癌預后判斷的指標。

結腸癌；PAK6；預后

P21活化激酶（p21-activated kinases，PAKs）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為P21活化激酶的6個家族成員之一，可通過下游眾多的激酶底物和結合蛋白參與眾多的生物學功能，被認為是腫瘤細胞信號網絡的關鍵調節因子，在細胞骨架重組、細胞遷移、細胞凋亡及基因轉錄調節等方面起重要作用[1-2]。最近研究發現P21活化激酶6（p21-activated kinase 6，PAK6）在肝癌和前列腺癌組織中高表達[3-4]，但是目前尚缺乏PAK6在結腸癌組織中的研究。本實驗旨在觀察PAK6表達與結腸癌患者臨床特點及預后的關系。

1 材料與方法

1.1一般資料

隨機抽取2007年1月-2010年12月福建省漳州市醫院普外科手術臘塊標本庫中94例結腸癌患者的癌組織和相應的正常結腸上皮組織。所有標本收集術前均獲得患者同意并獲得福建省漳州市醫院醫學倫理委員會批準。94例結腸癌患者中，女51例（54.26%），男43例（45.74%）；年齡35～88歲（中位年齡61歲）。美國癌癥聯合委員會(AJCC)分期Ⅰ期患者20例（21.28%），Ⅱ期患者30例（31.91%），Ⅲ期患者30例（31.91%），Ⅳ期患者14例（14.89%）。所有病例均達到肉眼下根治，并行術野的淋巴結清掃。所有病例術前均未行放、化療等抗腫瘤治療。隨訪間隔按照國際抗癌聯盟標準，為術后1～2年每3個月1次，第3年起每半年1次，第5年后每年1次。本研究隨訪截至時間為2014年6月1日。隨訪率為92.55%。

1.2RNA提取及cDNA合成

應用Trizol試劑盒（BBI公司，加拿大）隨機抽取25對組織標本抽提總RNA。用紫外分光光度計檢測RNA的濃度，根據在260和280 nm處的吸光度值，檢測RNA的純度，并經瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的質量。采用Fermentas（加拿大Fermentas公司）逆轉錄試劑盒以Oligo（dT）15為引物，由total RNA的3’Poly（A）區域引導出cDNA，反應條件：25℃5 min，42℃60 min，70℃5 min。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative PCR detecting system，qPCR）

以cDNA產物為模版，以β-actin為內參，設計并合成聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)引物，依據SYBR Green qPCR Master Mix（加拿大Fermentas公司）進行Real-time PCR反應。引物序列：PAK6，正向引物：5'-ATCTGGGAGAGAAGG CGAAC-3'；反向引物：5'-GGAGGACAAGGAGACAG CAG-3'；β-actin正向引物：5'-CTGGGACGACATGG AGAAAA-3'；反向引物:5'-AAGGAAGGCTGGAAGA GTGC-3'。qPCR反應條件：50℃2 min，95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共進行40個循環后72℃延伸5 min。反應完成后，取5μl擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳[5]。

1.4免疫組織化學法

所有94對標本均經10%福爾馬林固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規石蠟包埋、切片厚4～6μm，脫蠟，再水化。置于pH 6.0的檸檬酸緩沖液中行高壓抗原修復后，3%雙氧水（H2O2）封閉內源性過氧化物酶活性。一抗孵育[PAK6，1∶300，美國Abcam；細胞核增殖抗原（Ki67），1∶500，美國Abcam]，4℃冰箱濕盒內孵育過夜。滴加二抗（基因科技，GK500705），并置于37℃恒溫箱內孵育30 min。顯微鏡下二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，脫水至透明，中性樹膠封片。用已知結腸癌切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對照[6-7]。評分標準：著色強度評分（0分，無；1分，弱；2分，中；3分，強），免疫組化陽性細胞率評分（0分，＜5%；1分，5%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%），兩者之和為該病例評分值，設定評分0～2為陰性，＞2為陽性。

1.5統計學方法

應用SPSS 19.0統計軟件分析，計量資料組間差異比較采用配對t檢驗和方差分析。計數資料采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗，單因素生存分析用Kaplan-Meier法，用COX比例風險模型進行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1RNA抽提質量鑒定

經鑒定，最終所有樣本RNA在A260/A280的比值均在1.8～2.0，表明提取的RNA無明顯降解，達到所需純度。

2.2實時定量PCR（qPCR）

腸癌組織和癌旁組織中PAK6 mRNA表達水平差異有統計學意義（P＜0.01），結腸癌組織中PAK6 mRNA明顯增高，具體情況見表1、圖1。

表1 結腸癌組織與癌旁組織PAK6 mRNA表達水平（±s）

組別例數PAK6 mRNA相對表達t值P值結腸癌組織250.4010±0.0784.0810.0006癌旁組織250.1190±0.027

2.3免疫組化結果

94例結腸癌腫瘤組織中PAK6陰性者33例，陽性者61例。PAK6在正常組織低表達10.64%（10/94），在腫瘤組織中高表達64.89%（61/94），與qPCR檢測結果一致。PAK6表達與臨床病理資料的聯系見表2。PAK6在結腸癌組織中的表達水平與腫瘤分化程度、遠處轉移、AJCC分期及Ki67顯著相關（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤大小及腫瘤部位無顯著相關（P＞0.05）。見圖2。

2.4結腸癌組織中PAK6蛋白的表達與患者預后的關系

94例結腸癌患者的5年總體生存率為52.2%。根據PAK6蛋白表達程度相應地分成PAK6陽性組和PAK6陰性組，Kaplan-Meier生存曲線分析結果顯示PAK6陽性組結腸癌患者的5年無病生存率及5年總生存率分別為30.3%及33.9%，明顯低于PAK6陰性表達組的87.9%、84.8%，兩者間差異均有統計學意義（χ2=25.801，P＜0.01；χ2=20.807，P＜0.01，圖3）。在COX多因素回歸模型分析中，將患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤遠處轉移、分化、AJCC分期、PAK6表達水平及Ki67表達水平納入其中，結果發現PAK6蛋白表達是結腸癌患者無病生存率（P＜0.001）和總體生存率（P=0.003）的獨立預后因素（表3）。此外，AJCC分期和腫瘤遠處轉移也是結腸癌的獨立預后因子（P＜0.001）。

3 討論

腫瘤的發生發展是一個多基因、多階段的演變過程，小GTP蛋白酶Rho，Rac，Ras和Cdc42在一些重要的腫瘤中起作用[8]。PAKs作為Rac和Cdc42的效應器，生物研究顯示其通過促進細胞增殖、生存、運動和血管生成等腫瘤標記過程，在細胞惡性轉化中起關鍵作用[9]。PAKs包含6個亞型（PAK1-6），基因PAK6位于15q14，編碼75kDa的蛋白，含有能與Cdc42/Rac相互結合（CRID）的N端區域和C端激酶域，在哺乳動物多種癌癥中呈過表達、擴增或高反應狀態[10]。

自PAK6被發現以來，越來越多的研究集中于PAK6生物功能和作用機制。RNA印跡分析揭示PAK6在睪丸和前列腺組織中高表達[3]。PAK6可特異性直接抑制雄激素受體（androgen receptor，AR）的活性，進而抑制AR介導的轉錄過程[11]。此外，PAK6還可增強前列腺癌細胞對多西他賽的化療敏感性及對放射線的敏感性[12-13]，據此推測PAK6在癌癥的發展和治療過程中可能起著重要作用。

該實驗是首個報道PAK6高表達與結腸癌發生發展關系的研究。為了解PAK6在結腸癌組織中的表達情況，筆者隨機抽取了25對結腸癌患者臨床標本進行qPCR檢測，結果發現PAK6在腫瘤組織的mRNA表達水平顯著高于正常結腸癌組織（P＜0.01）。免疫組化顯示PAK6在94例結腸癌腫瘤組織中高表達64.89%（61/94），正常組織中只有10.64%（10/94）PAK6陽性。這些結果提示PAK在轉錄和轉錄后水平都是高表達，支持其作為新的結腸癌診斷的指標。臨床資料統計進一步分析顯示PAK6的表達量與腫瘤AJCC分期、腫瘤分化、Ki67表達量和腫瘤遠處轉移高度相關，這些相關性提示PAK6高表達會促進腫瘤的增殖和轉移。進一步對94例結腸癌手術患者進行Kaplan-Meier單因素生存分析，顯示PAK6陽性組患者5年無病生存率及總體生存率均明顯低于PAK6陰性組，其與預后呈負相關；多因素COX回歸模型分析發現PAK6表達是影響結腸癌預后相關的獨立危險因素。

該研究結果初步揭示了PKA6蛋白的表達水平與結腸癌臨床病理及預后的關系，提示PAK6可有助于判斷結腸癌生存預后。由于樣本量有限，PAK6對結腸癌的診治意義有待于進一步探討；相信，隨著臨床試驗和生物藥學研究的順利進行，PAK6可能是監測腫瘤臨床預后的有用指標。

[1]JAFFER ZM,CHERNOFF J.P21-activated kinases:three more join the Pak[J].The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,2002,34(7):713-717.

[2]FIELD J,MANSER E.The PAKs come of age:Celebrating 18 years of discovery[J].Cell Logist,2012,2(2):54-58.

[3]KAUR R,YUAN X,LU ML,et al.Increased PAK6 expression in prostate cancer and identification of PAK6 associated proteins [J].Prostate,2008,68(14):1510-1516.

[4]CHEN H,MIAO J,LI H,et al.Expression and prognostic significance of p21-activated kinase 6 in hepatocellular carcinoma [J].J Surg Res,2014,189(1):81-88.

[5]陳子華,葛杰,陳志康,等.CDX2和CEA在人結腸癌組織中的表達及意義[J].中國現代醫學雜志,2008,18(14):1991-1994.

[6]任權,劉明國,向軍英,等.452例大腸癌的內鏡及病理分析[J].中國內鏡雜志,2007,13(3):282-284.

[7]李建國,華建江,黃大毛,等.SH2-B在結腸癌組織中表達及臨床意義[J].中國現代醫學雜志,2010,20(13):2004-2007.

[8]ORGAZ JL,HERRAIZ C,SANZ-MORENO V.Rho GTPases modulate malignant transformation of tumor cells[J].Small GTPases,2014,5(2):290-293.

[9]YE DZ,FIELD J.PAK signaling in cancer[J].Cell Logist,2012, 2(2):105-116.

[10]SHEPELEV MV,KOROBKO IV.Pak6 protein kinase is a novel effector of an atypical Rho family GTPase Chp/RhoV[J]. Biochemistry(Mosc),2012,77(1):26-32.

[11]SCHRANTZ N,DA SILVA CORREIA J,FOWLER B,et al. Mechanism of p21-activated kinase 6-mediated inhibition of androgen receptor signaling[J].J Biol Chem,2004,279(3): 1922-1931.

[12]WEN X,LI X,LIAO B,et al.Knockdown of p21-activated kinase 6 inhibits prostate cancer growth andenhances chemosensitivity to docetaxel[J].Urology,2009,73(6):1407-1411.

[13]ZHANG M,SIEDOW M,SAIA G,et al.Inhibition of p21-activated kinase 6(PAK6)increases radiosensitivity of prostate cancer cells[J].Prostate,2010,70(8):807-816.

Expression and clinical significance of p21-activated kinase 6 in colon cancer

Fei WANG1,Jian-guo LI2,Qiao-bin WU1,Long DENG1,Jie LUO1,Zai-ye LI3
(1.Department of General Surgery;2.Department of Hepatobiliary,Pancreas and Spleen Surgery, Zhengxing Hospital,Zhangzhou,Fujian 363000,P.R.China;3.Xiangya School of Medicine,Central South University,Changsha,Hunan 410013,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of p21-activated kinase 6 and its clinical significance in colon cancer.【Methods】Use reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)and quantitative real-time PCR(qPCR)to test the expression of PAK6 mRNA in 25 paired tissues of colon cancer,and use the method of immunohistochemistry to test the expression of PAK6 in 94 paired cancer tissues.【Results】The results of qPCR showed that the average expression value of PAK6 mRNA in colon cancer tissues is actually higher than the normal tissues(P＜0.01).Immunohistochemical detection of PAK6 among 94 paired specimens showed seldom expression in normal tissues which only occupies 10.64%,while it highly expressed among the cancer tissues which account for 64.89%.Increased PAK6 was significantly associated with advanced AJCC stage index,tumor histologic grade,Ki67 expression and distant metastasis(P＜0.05).Kaplan-Meier univariate survival analysis revealed that five-year disease-free survival and overall survival rate for patients with positive PAK6 expression were significantly lower than those with negative PAK6 expression(P＜0.01).Multivariate Cox regression analysis revealed that PAK6 expression was an independent prognostic factor in disease-free survival and overall survival for patients with colon cancer.【Conclusion】The expression of PAK6 in colon cancer is significantly increased,it is probably a prognostic marker for colon cancer.

colon cancer;PAK6;prognosis

R737.14

A

1005-8982（2015）28-0007-05

2015-05-10

李建國，E-mail：jjxln649@163.com