離子束誘變與連續馴化選育耐毒性產丁醇菌株

金超楠，劉 莉，史吉平，孫慶元

（1.大連工業大學生物工程學院，遼寧大連116034；2.中國科學院上海高等研究院，上海201210）

離子束誘變與連續馴化選育耐毒性產丁醇菌株

金超楠1，2，劉 莉2，史吉平2，孫慶元1*

（1.大連工業大學生物工程學院，遼寧大連116034；2.中國科學院上海高等研究院，上海201210）

利用離子束注入的方法對丁醇發酵菌株拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NCIMB 8052進行誘變，篩選得到了突變株拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CN18，相對于出發菌株，該突變株的丁醇產量從9.9 g/L增加至12.8 g/L，提高了29.3%；總溶劑產量從13.4 g/L增加至18.2 g/L，提高了35.8%。該突變菌株連續傳代20次，溶劑產量穩定，菌株無明顯退化。使用含木質素降解產物的培養基對該菌株進行連續培養馴化，最終獲得一株耐木質素降解產物的高產突變株，命名為拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CN88，其耐受木質素降解產物的質量濃度提高至1.0 g/L。在0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L的抑制物質量濃度下發酵，可分別產總溶劑15.2 g/L、14.4 g/L、12.7 g/L。

拜氏梭菌；離子束誘變；連續培養；抑制物；遺傳穩定性

石油等能源危機促使人們尋求新型能源來代替傳統的化石燃料。生物質能源是最具潛力的可替代能源之一，其中，丁醇作為第二代生物質能源，展現了更多應用上的優勢，在許多國家中已經進行了代替燃料用油的實驗計劃[1-3]。利用生物質原料生產丁醇一般要經過三步，即預處理、酶解、發酵[4]。由于菌種無法耐受木質纖維素降解單體的抑制作用，導致菌體生長受到嚴重抑制，最終導致溶劑產量很低，成為了廣泛推廣應用的瓶頸[5-6]，因此尋找和選育的高產耐毒菌株是必要的[7]。

目前對于菌種改造主要有兩種方法：（1）基因工程菌的構建[8]，（2）傳統的誘變方法[9-10]。低能量的離子束注入誘變技術在1991年第一次應用于大米育種[11]。這種誘變方法有很多優勢，如低損傷率、高誘變率、更廣泛的光譜范圍等[12]。可利用此種誘變方法提高出發菌株對于木質素單體抑制物的耐受性，同時保證菌種高產。另外，可以通過菌種馴化方法來進一步提升其耐丁醇和木質素單體的毒性以及丁醇的生產能力[13-14]。

該實驗利用離子束注入方法誘變出發菌株拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NCIMB 8052，并結合連續培養的馴化方式，對菌種進行進一步改造，從而獲得耐木質素降解產物的高產丁醇突變株，為開發直接利用生物質酶解液而不經過脫毒步驟的發酵方法奠定了基礎，相關的研究結果也對生物質轉化和利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本實驗所使用的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NCIMB 8052，購于美國菌種保藏中心。

1.1.2培養基

TYA種子培養基：葡萄糖40.0 g，酵母粉2.0 g，蛋白胨6.0 g，牛肉粉2.0 g，NH4AC 3.0 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，K2HPO40.50 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水定容至1 L，自然pH值，115℃滅菌15 min。

發酵培養基：葡萄糖50.0 g，其他同TYA種子培養基。

選擇培養基：發酵培養基中加入等量的各種混合抑制物（對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸、丁香酸、丁香醛、香草酸、香草醛、香豆酸以及阿魏酸），配制成含不同總質量濃度抑制物的一系列選擇培養基（0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L）。

1.1.3 化學試劑

葡糖糖、酵母粉、蛋白胨、瓊脂、正丁醇、NH4AC、MgSO4·7H2O、K2HPO4、FeSO4·7H2O、牛肉粉、木糖、甘油等化學試劑均為分析純：國藥集團化學試劑有限公司；正丁醇、乙醇、丙酮、甲酸、乙酸均為色譜純：美國Sigma試劑公司。

1.2 儀器與設備

離子束誘變臺：濟南杰康設備凈化廠；LC-20A高效液相色譜儀、GC-2010plus高效氣相色譜儀：日本SHIMADZU公司；MDF-U53V-80℃超低溫冰箱：日本三洋公司；AW400SG厭氧培養箱：英國依萊泰科公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養

從-80℃冰箱取出種子，置于冰上融化后轉接到含10 mL種子培養基的試管中，在沸水中熱激1.0 min，迅速放入冷水中使之冷卻，37℃恒溫培養箱中靜置培養24 h，然后按10%的接種量轉入含有40 mL種子培養基的100 mL三角瓶，在37℃恒溫培養箱中靜置培養24 h后用于實驗。

1.3.2 低能N+離子束注入誘變

將培養24 h的二級種子離心去上清液，加入等量的生理鹽水洗滌，再次離心去上清液后用等量的培養基懸浮菌體，放入含有玻璃珠的100 mL三角瓶中打勻，使菌落的個數大約在108個/mL，取5 mL菌液放入玻璃培養皿中，再用過膜的無菌空氣將其干燥，制造出干膜細胞。接下來放到誘變儀器的托盤上，分別用10 keV能量的范圍為0、2×1014N+/cm2、4×1014N+/cm2、6×1014N+/cm2、8×1014N+/cm2、10×1014N+/cm2的離子束劑量對菌體進行誘變，整個過程的操作均在真空環境下進行（10-3Pa），時長55 s，脈沖5 s。然后將菌液稀釋不同的梯度進行涂布，進行平板培養，避光放置于厭氧培養箱中培養24 h，進行菌落計數，計算致死率（存活率=1-致死率），確定最佳的離子束誘變劑量[15]。

1.3.3 遺傳穩定性實驗

將篩選得到的菌株在液體TYA培養基中連續傳代20次，37℃靜置培養48 h，氣相色譜（gas chromatography，GC）法測定溶劑產量，每代做2個平行。

1.3.4 連續培養馴化

將培養到對數生長期的菌液按照1∶10的比例接種到連續培養系統（500 mL，密閉），此時的選擇培養基含抑制物質量濃度為0.6 g/L。24 h后開始進行連續發酵培養，補料速度為10 mL/h。每隔24 h取樣，通過測量發酵液的OD600nm值和pH值來指示菌體在培養基中的生長和代謝情況。連續馴化過程中，每隔5 d提升一次進料培養基的抑制物質量濃度（每次提升0.2 g/L），直至菌體無法耐受導致死亡，以此來達到馴化菌體耐毒性的目的。

1.3.5 發酵液溶劑及有機酸的測定方法

氣相色譜儀Shimadzu 2010 Plus測定丁醇、丙酮、乙醇及乙酸、丁酸的含量。色譜條件：毛細管色譜柱Inert Cap Pure Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：50℃保持3.8 min，以20℃/min升至220℃，保持3 min；進樣口溫度200℃，火焰離子檢測器（flame ionization detector，FID）溫度230℃；載氣N2流速1.0 mL/min，H2流速40.0 mL/min；空氣流速400.0 mL/min；進樣量0.5 μL；分流比50∶1。采用內標法定量，內標物為異丁醇。

2 結果與分析

2.1 低能N+離子束注入誘變

分別用10 keV能量的范圍為0、2×1014N+/cm2、4×1014N+/cm2、6×1014N+/cm2、8×1014N+/cm2、10×1014N+/cm2的離子束劑量對菌體進行誘變，結果見圖1。

由圖1可知，不同誘變劑量下菌體的存活率（存活率= 1-致死率）在6×1014N+/cm2時恰好形成一個“馬鞍型”曲線，一般認為80%的菌體致死率是誘變的最佳結果，因此馬鞍處的20%存活率劑量即為最適的誘變劑量。此時的誘變可以達到最高效率，既使得菌體死亡數多，又使得存活下來的菌體數量足夠且生命力強。因此選擇6×1014N+/cm2的離子束劑量參數下對出發菌株進行多輪誘變。

2.2 遺傳穩定性實驗

經最佳劑量多輪誘變處理后的菌液，經過24 h的中間避光富集培養，按1%的接種量轉入種子培養基中培養，再將菌液涂布于固體TYA培養基上，在厭氧培養箱中培養36 h。挑選較大的菌落轉接到TYA液體種子培養基，并轉搖瓶發酵，以48 h為發酵終點，取樣進行氣相色譜測定。篩選丁醇產量高的菌株，獲得產量最高的突變株，命名為拜氏梭菌（C.beijerinckii）CN18。

對突變菌株拜氏梭菌（C.beijerinckii）CN18進行20代連續培養實驗，每代搖瓶發酵48 h，用氣相色譜儀測定溶劑產量，實驗結果見圖2。

由圖2可知，傳代20次以內，菌株C.beijerinckiiCN18的發酵特性基本沒有退化，丁醇、乙醇、丙酮的產量基本平穩，說明此突變菌株遺傳特性非常穩定，比較適合工業化應用。

2.3 拜氏梭菌（C.beijerinckii）CN18發酵結果

對比突變株C.beijerinckiiCN18與出發菌株C.beijerinckiiNCIMB8052在不同抑制物質量濃度條件下，發酵48 h后產丁醇、乙醇、丙酮、丁酸等溶劑的能力，結果見圖3。

由圖3可知，無論是溶劑產量或是耐毒性，突變株都比出發菌株優異得多。在沒有抑制物存在的發酵培養基中，C.beijerinckiiCN18可以利用底物發酵產出18.2 g/L總溶劑，其中包括12.8 g/L丁醇、0.6 g/L乙醇、4.8 g/L丙酮；而C.beijerinckiiNCIMB 8052只能產出13.4 g/L總溶劑，其中包括丁醇9.9 g/L，乙醇0.4 g/L，丙酮3.1 g/L。突變株的總溶劑產量提高了35.8%，丁醇產量提高了29.3%。另外，突變株的耐毒性也有顯著提高，在抑制物質量濃度＞0.6 g/L之后，出發菌株的溶劑產量急劇下降，抑制物質量濃度＞0.8 g/L之后總溶劑產量≤3 g/L；而突變株在抑制物質量濃度為1.0g/L時仍然可以產出近12g/L的總溶劑，可見其耐毒性有顯著提高。因此C.beijerinckiiCN18可作為進一步耐毒性研究和利用生物質原料水解液的極具潛力的菌株。

2.4 連續培養馴化選育出C.beijerinckiiCN88

利用連續培養的方法對菌種進行耐毒性馴化，最終使得突變菌株對木質素單體抑制物的耐受性有進一步的提高，結果如圖4所示。

由圖4可知，在連續培養過程中，初始抑制物質量濃度為0.6 g/L，5 d為一個周期，第6天抑制物質量濃度提高至0.8 g/L，第11天抑制物質量濃度提高至1.0 g/L，第16天抑制物質量濃度提高至1.2 g/L。每次菌體進入到更高一級抑制物濃度時，OD600nm值都會開始下降，同時pH值升高，隨著時間的推移，OD600nm值會慢慢回升，pH值會下降，直至一個平衡的狀態。這是由于菌體生長代謝分為兩個階段：產酸期及產溶劑期。在剛剛接入菌體時，由于抑制物質量濃度過高，不利于菌體生長，所以細胞濃度有所下降。經過一段時間，菌體適應了新環境，開始大量增殖，代謝進入了產酸期，因此pH值會下降，同時細胞濃度開始慢慢回升，直至一個穩定平衡的階段。之后在進入新抑制物質量濃度環境時，此過程又重復一次，已經適應了上一質量濃度的細胞生長再次收到抑制，然后在適應新環境，細胞濃度回升至平穩，pH值先下降后上升。直至達到1.2 g/L抑制物質量濃度時，細胞濃度下降后再也沒能回升，菌液渾濁度不再增加，pH值持續升高，即判斷該濃度為此次馴化的終點濃度，1.2 g/L的抑制物質量濃度是C.beijerinckiiCN18耐受的最大限度。將馴化后的菌種保存好，重新命名為拜氏梭菌（C.beijerinckii）CN88。

2.5 C.beijerinckiiCN88在有抑制物存在的培養基中發酵

由圖5可知，各培養基中抑制物質量濃度分別為0.6g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L時，C.beijerinckiiCN88可以分別通過厭氧發酵產出總溶劑15.2 g/L、14.4 g/L、12.7 g/L、5.2 g/L。可見，經過誘變和馴化C.beijerinckiiCN88的抑制物耐受程度有了顯著提高，并且同時保證溶劑的產量不會大幅降低。該菌株可以耐受1.0 g/L的木質素降解產物。實際應用木質纖維素水解液發酵時，抑制物種類更多，但C.beijerinckiiCN88已對其中抑制效果最明顯的幾種有了耐受性，可以進一步嘗試該菌株以木質纖維素水解液為底物進行直接發酵。

3 結論

通過對出發菌株C.beijerinckiiNCIMB 8052進行離子束誘變處理，篩選得到了突變株C.beijerinckiiCN18，該菌株相對于出發菌株丁醇產量從9.9 g/L增加至12.8 g/L，提高了29.3%；總溶劑從13.4g/L增加至18.2g/L，提高了35.8%。經過20次連續傳代實驗，該突變菌株具有良好的遺傳穩定性。經過連續培養馴化，得到的C.beijerinckiiCN88可以耐受1.0 g/L的木質素降解產物，在抑制物質量濃度為1.0 g/L時，馴化后的菌株可產出12.7 g/L總溶劑，比出發菌株產出的1.9 g/L總溶劑提高了5.7倍；比C.beijerinckiiCN18產出的11.6 g/L總溶劑提高了9.5%。這為今后直接利用生物質水解液發酵產丁醇奠定了基礎。

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Screening of inhibitor-tolerant and butanol producing strain by ion beam implantation and continuous culturing domestication

JIN Chaonan1,2,LIU Li2,SHI Jiping2,SUN Qingyuan1*
(1.School of Bioengineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 2.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China)

The mutation method of ion beam implantation was employed toClostridium beijerinckiiNCIMB 8052 in this study.As a result,a mutant strainC.beijerinckiiCN18 was screened.Comparing to the original strain,the buranol production increased from 9.9 g/L to 12.8 g/L,which improved 29.3%.Meanwhile,the total solvent production was 18.2 g/L,which was 35.8%higher than the original data of 13.4 g/L.Additionally,C.beijerinckiiCN18 could maintain stable solvent production during 20 times serial passages,which showed excellent genetic stability.In the following,a mutant strainC.beijerinckiiCN88 with high resistance of lignin-degraded products was obtained after continuous culturing domestication,which could grow well even under 1.0 g/L inhibitor.Under the inhibitor concentrations of 0.6 g/L,0.8 g/L and 1.0 g/L,it could produce 15.2 g/L,14.4 g/L and 12.7 g/L total solvents,respectively.

Clostridium beijerinckii;ion beam implantation;continuous culturing domestication;inhibitor;genetic stability

Q939.99

A

0254-5071（2015）06-0025-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.006

2015-05-17

國家自然科學基金青年科學基金（21306219）；中國科學院青年創新促進會專項經費（2015232）；中國科學院上海高等研究院交叉學科青年創新基金（141002）

金超楠（1989-），男，碩士研究生，研究方向為微生物發酵。

*通訊作者：孫慶元（1957-），男，教授，博士，研究方向為微生物降解農藥殘留以及食（醫）用真菌的開發。