噴霧干燥法制備冰酒發酵劑的研究

蔣 麗，董 丹，邢亞閣，車振明，羅建峰

（1.西華大學生物工程學院食品生物技術重點實驗室，四川成都610039；2.理縣塔斯酒莊有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州623100）

噴霧干燥法制備冰酒發酵劑的研究

蔣 麗1，董 丹1，邢亞閣1，車振明1*，羅建峰2

（1.西華大學生物工程學院食品生物技術重點實驗室，四川成都610039；2.理縣塔斯酒莊有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州623100）

從四川藏區高原霞多麗冰葡萄渣中分離純化出了一種菌株，經18S rDNA D1/D2序列鑒定為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum），并通過正交試驗對保護劑的配方進行優化，單因素試驗初步研究噴霧干燥的的條件。結果表明，噴霧干燥最佳保護劑的配方為脫脂奶粉7%，酵母浸粉5%，乳糖0.6%，黃原膠0.20%，得到的干菌粉中的活菌數為2.6×1010CFU/g；確定噴霧干燥實驗最適條件為進口溫度120℃，進樣流量20 mL/h，保護劑與菌泥比例4∶1（g∶L），按上述條件得到的干菌粉的活菌數為2.4×108CFU/g。

噴霧干燥；發酵劑；保護劑

冰酒（ice wine）是一種甜葡萄酒。是指在氣溫較低時，利用在葡萄樹上自然冰凍的葡萄釀造的葡萄酒。在我國，按照國家標準GB/T 25504—2010《冰葡萄酒》的定義，冰葡萄酒是指：將葡萄推遲采收，當自然條件下氣溫低于-7℃使葡萄在樹枝上保持一定時間，結冰，采收，在結冰狀態下壓榨，發酵釀制而成的葡萄酒（在生產過程中不允許外加糖源）[1-3]。冰酒釀造過程中離不開酵母菌的作用，它們將葡萄原料中的糖分轉化成酒精，但是在自然發酵過程中不易被控制，而且發酵周期又長，酒品質量得不到保證[4-5]?；钚愿山湍赴l酵如果被大量引進國內，會造成國內的冰酒口味與國外的趨同化，沒有了中國冰酒的特點，制約了具有中國地域特色冰酒的生產[6]。制備出四川專用冰酒發酵菌劑這不僅可以解決自然發酵中存在的問題，還能釀造具有地區特色的優質冰葡萄酒。

目前發酵劑的生產主要采用真空冷凍干燥和噴霧干燥，根據相關文獻證明[7-9]，雖然真空冷凍干燥凍干的發酵菌粉具有相當高的活力，但是生產時間、產量較小、成本較高、不適合大批量的生產，而且產品成塊狀，不利于發酵使用，噴霧干燥在食品工業中，是一種生產率高，操作費用低的工藝[10-11]。因此本研究通過噴霧干燥方法制備冰酒專用發酵菌劑，優化發酵菌劑的制備工藝和參數，旨在找到一種高效率、低成本生產冰酒發酵菌劑的方法。為四川高原藏區跨越式發展過程中特色冰葡萄酒產業——冰葡萄酒專用發酵菌劑開發及在冰葡萄酒標準化生產中推廣應用項目提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）X7：由塔斯酒莊提供的冰葡萄渣中分離所得。

多孔淀粉、酵母提取物：上海試劑二廠；脫脂奶粉：天津雀巢公司；阿拉伯膠、黃原膠、明膠（均為食品級）：天津市北方天醫化學試劑廠；乳糖：山東浩瀚食品添加劑有限公司；三磷酸腺苷酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、DNAmarker：天為時代有限公司；18S rDNAD1/D2擴增引物：上海生物工程有限公司；乙醇、乙酸、蔗糖：成都科龍化工廠。

1.2 儀器與設備

DHP-9052型電熱恒溫培養箱：黃石市恒豐醫療器械有限公司；YH-200小型噴霧干燥機：上海世遠生物設備工程有限公司；DHP-9052型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠實驗儀器公司；ABI3700基因測序儀：北京新陽創業科技發展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA提取和18S rDNA D1/D2區序列擴增及檢測

參照文獻[12]的試驗方法對酵母菌的DNA進行提取，采用18SrDNA序列分析法對分離出的菌種進行分子鑒定[13]。PCR條件概括：聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）體系：30 μL重蒸水，5 μL 10倍PCR擴增緩沖液（Mg2+Free），6 μL MgCl2（25 mmol/L），4 μL三磷酸脫氧核苷酸（d NTP）（2.5 mmol/L），正向引物NS1（5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3）和反向引物NS8（5-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3）各1 μL，1 μLTaq聚合酶（2.5 U/μL），2 μL總DNA模板。

PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，經30個循環后最終72℃保持10 min，然后等溫度降到4℃停止運行。

將PCR產物經過儀器純化后直接送去上海英駿生工有限公司用ABI3700基因測序儀進行測序，通過用Chromas參照正反序列圖譜人工校對測序結果進行比對。根據測試菌株的D1/D2區序列，運用電腦上的Blast程序在Gen-Bank數據庫中分別進行同源序列搜索[13]。

1.3.2 菌種活化培養與收集

將活化好的酵母菌X7，按4%接種量接入到酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基中，29℃培養24 h后，5 000 r/min、4℃離心15 min，棄去上清液，收集菌體。

1.3.3 保護劑優化單因素試驗

（1）保護劑對葡萄汁有孢漢遜酵母的影響

發酵液中分別添加多孔淀粉、酵母提取物、脫脂奶粉作為菌劑的保護劑，這3種保護劑分別選取添加量為3%、5%、7%制成懸浮液。由于乳糖是用于維持酪蛋白復合物穩定性的必需品，因此選取乳糖添加量分別為0.2%、0.3%、 0.4%、0.5%制成懸浮液。利用噴霧干燥機對葡萄汁有孢漢遜酵母發酵液進行熱風噴霧干燥，熱風噴霧干燥的進口溫度120℃，相應的出口溫度選擇為60～70℃，收集粉末狀的固形物，即得發酵菌劑。

（2）抗熱保護性膠體的選擇

發酵液中分別添加阿拉伯膠、黃原膠、明膠作為抗熱保護劑，3種保護劑分別選取0.1%、0.2%、0.3%的濃度進行添加。利用噴霧干燥機對葡萄汁有孢漢遜酵母發酵液進行噴霧干燥，進口溫度選擇120℃進行噴霧干燥，60～70℃是其出口溫度，然后收集所得固形物，即得發酵菌劑。制備平板培養基，將菌劑進行懸浮稀釋后進行平板培養，計算菌劑中活菌數含量，研究保護劑對葡萄汁有孢漢遜酵母噴霧干燥的影響。每組試驗3個平行，從而選出比較理想的抗熱保護性膠體。

1.3.4 正交試驗

進行噴霧干燥保護劑的優化，在進口溫度120℃、進樣流量20 mL/L的條件下，結合實驗室前期試驗結果和相關文獻，選取酵母提取物、脫脂奶粉、黃原膠、乳糖，進行4因素3水平的正交試驗，噴干后測定樣品活菌數，正交試驗因素與水平見表1。

1.3.5 噴霧干燥條件單因素試驗

噴霧干燥進口溫度對樣品的影響：設定進樣流量是20 mL/h，保護劑與菌泥的比例是3∶1（g∶L），試驗選擇110℃、115℃、120℃、125℃和130℃作為進風溫度進行試驗。

噴霧干燥進料流量對樣品的影響：設定保護劑與菌泥的比例是3∶1（g∶L），進口溫度設定為120℃，在10 mL/h、15 mL/h、20 mL/h、25 mL/h和30 mL/h的進料流量下分別進行噴霧干燥。

保護劑與菌株配比對樣品的影響：設定進樣流量是20 mL/h和進風溫度為120℃，將保護劑與菌泥分別按1∶1、3∶1、4∶1、8∶1、12∶1（g∶L）的比例混合后，在最優進口溫度和進樣流量條件下進行噴霧干燥，測定干燥粉的活菌數。

1.3.6 產品中活菌數和存活率的測定[16]

平板計數法：在超凈臺里進行無菌操作，稱取1 g發酵菌粉溶解到10 mL的無菌蒸餾水中，然后進行逐級梯度稀釋，選用能計數的3個梯度進行平板計數，用移液管向每個瓶皿注入l mL的該梯度的菌液，每個梯度做3個平行。向各個培養皿中倒入15～20 mL虎紅培養基中，搖勻培養皿，輕輕放置在超凈臺直到培養基完全凝固。將培養皿倒置于28℃培養箱中，培養48 h后計數?；罹鷶涤嬎愎饺缦拢?/p>

活菌數（CFU/g）=每個瓶皿菌數的平均數×稀釋倍數

2 結果與分析

2.1 酵母DNA的提取

標準品基因和目的基因的擴增電泳結果見圖1。根據電泳圖的亮斑可知，本次實驗的DNA提取成功，可以進行PCR擴增18S rDNA。

由圖1可知，所擴增片段的大小在1.5 kb～2.0 kb，和真核生物的18S rRNA/DNA基因片段大小一致，因此達到了對酵母的18S rDNA基因的PCR擴增目的。通過電泳檢測的的完整的18S rDNA基因，送公司測序。根據序列比對結果，鑒定出該酵母菌為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。

2.2 抗熱保護劑對葡萄汁有孢漢遜酵母菌的影響

保護劑對葡萄汁有孢漢遜酵母噴霧干燥的影響結果如表2所示，試驗結果表明，葡萄汁有孢漢遜酵母菌發酵液噴霧干燥過程中，添加保護劑對菌體細胞具有保護作用。由表2可知，不添加保護劑時，噴霧干燥后菌劑所含活菌數為35 CFU/g，添加保護劑后，菌劑中的活菌數明顯提升，酵母浸粉作為保護劑優于多孔淀粉脫脂奶粉作為保護劑明顯優于其他2種保護劑，5%的脫脂奶粉作為保護劑噴霧干燥所得的活菌數可達9.6×108CFU/g。這是因為脫脂奶粉含蛋白質含量高，而蛋白質作為壁材，在于其分子帶有許多雙水基團，在形成微膠囊時，親水基深入水相，疏水基吸附于油溶性物質表面，這樣對菌粉中的菌起到了保護作用[15]。雖然效果最佳的抗熱保護劑是脫脂奶粉，但是用脫脂奶粉作為噴霧干燥的保護劑，其生產成本大，不利于工業生產，本試驗采用脫脂奶粉和酵母浸粉的混合物進行噴霧干燥試驗。

2.3 乳糖對葡萄汁有孢漢遜酵母菌的影響

乳糖在膠囊制劑的生產中可用來改善主要活性成分的流動性，使?？滋畛渚鶆?，并可能提高生產效率。乳糖是用于維持酪蛋白復合物穩定性的必需品，其對葡萄汁有孢漢遜酵母菌干燥的影響見表3。由表3可知，添加一定量的乳糖對菌起到了明顯的作用，隨著添加量的變化，其活菌數也隨著變化。當添加0.4%的乳糖時，其活菌數最高，達到3.0×105CFU/g，超過這添加量后活菌數就降低。當噴霧干燥時，乳糖可保護酪蛋白復合物在乳中的溶解度。缺乏乳糖時，由于酪蛋白復合物不穩定，易分解，導致其含量約減少1/2，而補充乳糖時其含量恢復。

2.4 抗熱保護性膠體的選擇結果

由于噴霧干燥過程中設置的溫度都比較高，對菌會有一定的傷害，因此必須選擇保護劑。添加這三種抗熱保護劑后，均對活菌起到了一定的保護作用，不同保護性膠體對葡萄汁有孢漢遜酵母菌活菌數的影響見表4。由表4可知，當沒有添加抗熱保護劑時，測得菌粉中的活菌數比加了抗熱保護劑的菌粉活菌數少；這3種抗熱保護劑的效果具有顯著差異，結果表明，黃原膠的抗熱效果最佳，明膠的抗熱效果比阿拉伯膠的抗熱效果好，當添加0.2%的黃原膠時，對菌的保護效果最好，菌粉中的活菌數能達到6.3×108CFU/g。故選擇黃原膠作為最佳抗熱性保護膠體進行后續試驗。

2.5噴霧干燥保護劑的正交試驗優化結果

由表5可知，4個因素的保護效果依次是：脫脂奶粉＞黃原膠＞乳糖＞酵母浸粉，最佳保護劑組成為A3B1C3D2，最佳保護劑組成為脫脂奶粉7%，酵母浸粉5%，乳糖0.6%，黃原膠0.20%，按上述條件得到的干菌粉中的活菌數為26.06×109CFU/g。從表6中方差分析可以看出，脫脂奶粉含量、乳糖和黃原膠含量對菌劑中活菌數都有著顯著性的影響（P＜0.05）。

2.6 噴霧干燥條件單因素試驗結果與分析

2.6.1 不同進口溫度的影響

進口溫度對發酵劑活菌數的影響見圖2。由圖2可知，發酵菌劑活菌數達到最高的是進口溫度為120℃，活菌數為3.5×108CFU/g，發酵劑顏色呈米黃色，粉末狀，具有酵母奶香味；當進口溫度達到125℃時，活菌數極具降低，只有15×106CFU/g，發酵劑呈淡黃褐色，有細小的塊狀物，說明某些樣品因進口溫度過高而失活變形。故選擇進口溫度為120℃。

2.6.2 進樣流量的影響

噴霧干燥時的進樣流量大小對發酵菌粉的活力同樣具有影響[17]。選擇10 mL/h、15 mL/h、20 mL/h、25 mL/h和30 mL/h 5個不同流量進樣，檢測樣品中的活菌數，結果如圖3所示。由圖3可知，菌粉中的活菌數會隨著進樣流量的變化而變化，且進樣流量很小時，活菌數也少，當進樣流量達到20 mL/h時，活菌數達到最大為4.2×108CFU/g，此后隨著進樣流量的增大活菌數降低，故選擇進樣流量為20 mL/h。

2.6.3 不同保護劑與菌泥配比例對菌劑活菌數的影響

將不同比例的保護劑與菌泥混合均勻，然后進行噴霧干燥，對樣品中的活菌數進行測定，結果見圖4。由圖4可知，當使用保護劑的用量偏少時，活菌數明顯偏少，不能對菌體起到有效的保護作用，導致在噴干過程中死亡；而當保護劑過多時，樣品中菌體的比例變小，所以活菌數會有輕微的下降，也會造成保護劑的大量浪費。隨著保護劑與菌泥比例的增加，菌劑中的活菌數也隨著變大，當其比例超過4∶1（g∶L）時，活菌數不再增加，反而迅速下降，因此可確定保護劑與菌泥的最佳比例是4∶1（g∶L），此時活菌數量達到最大為3.52×108CFU/g。

3 結論

從四川藏區高原威代爾冰葡萄果實中分離純化出的菌株，采用18S rDNA D1/D2進行了基因鑒定，鑒定出的酵母菌是葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）。然后對葡萄汁有孢漢遜酵母噴霧干燥保護劑和噴霧條件進行優化，保護劑采用4因素3水平的正交試驗，4種添加物的保護效果依次為：脫脂奶粉＞黃原膠＞乳糖＞酵母浸粉，最佳配方為脫脂奶粉7%，酵母浸粉5%，乳糖0.6%，黃原膠0.20%，按上述條件得到的干菌粉中的活菌數為26.06×109CFU/g。通過單因素試驗確定了噴霧干燥實驗最適條件：進口溫度120℃，進樣流量20 mL/h，保護劑與菌泥比例4∶1（g∶L），按上述條件得到的干菌粉的活菌數為2.4×108CFU/g。

[1]張麗珠，邢亞閣，許青蓮，等.川藏高原威代爾冰葡萄中酵母菌的分離、篩選及其耐受性研究[J].中國釀造，2013，32（10）：94-97.

[2]許青蓮，邢亞閣，車振明，等.川西高原冰酒發酵中Pichia anomala的鑒定與耐受性研究[J].中國釀造，2013，32（8）：39-41.

[3]蔣麗，刑亞閣，車振明，等.川藏高原冰葡萄酒中五種酵母菌的鑒定及耐受性研究[J].中國釀造，2014，33（10）：36-39.

[4]崔艷.菌種選育技術在葡萄酒釀造中的應用與發展[J].食品研究與開發，2011，32（9）：171-175.

[5]程雷.葡萄自然發酵過程中酵母的分離鑒定及優良葡萄酒酵母篩選[D].哈爾濱：東北林業大學碩士論文，2010.

[6]王國平.寧夏御馬葡萄酒廠野生酵母菌株的分離鑒定及分子鑒定[J].中國釀造，2009，28（8）：38-41.

[7]石美芬.直投式霉豆渣發酵劑的研制與初步應用[D].廣州：華南理工大學碩士論文，2012.

[8]彭曉群，王儒，許喜林，等.噴霧干燥法制備直投式霉豆渣發酵劑的研究[J].中國釀造，2014，33（9）：34-37.

[9]劉廣文.噴霧干燥實用技術大全[M].北京：中國輕工業出版社，2001.

[10]羅佳琦，于曉晨，于才淵.嗜酸乳桿菌噴霧干燥技術的研究[J].干燥技術與設備，2008，6（6）：273-278.

[11]李騫，欒天奇，王艷萍.噴霧干燥法制備植物乳桿菌MA2發酵劑[J].天津科技大學學報，2011，26（5）：19-22.

[12]KURTZMAN C P,FELL J W.The yeasts,a taxonomic study(4th edition)[M].Amsterdam:Elsevier Press,1998.

[13]蔣麗，董丹，邢亞閣，等.5種酵母菌的性能測定以及系統發育樹分析[J].中國釀造，2015，34（3）：35-39.

[14]KURTZMAN C P,ROBNETT C J.Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit(26S)ribosomal DNA partial sequences[J].Anton Leeuw,1998,73(10):331-371.

[15]郭志剛，劉天明，趙長增，等.甘肅天然優良酵母菌株的發酵特性評價[J].中國釀造，2008，27（11）：19-22.

[16]姚輝，于才淵.噴霧干燥制備微膠囊技術在食品工業中的運用[J].干燥技術與設備，2004，24（1）：8-11.

[17]李騫，欒天奇，王艷萍.干燥法制備植物乳桿菌MA2發酵劑[J].天津科技大學學報，2011，26（5）：19-35.

Preparation of fermentation starter of ice wine by spray drying method

JIANG LI1,DONG DAN1,XING Yage1,CHE Zhenming1*,LUO Jianfeng2
(1.Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan,College of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China; 2.Lixian Tasijiuzhuang Co.,Ltd.,Chengdu 623100,China)

Hanseniaspora uvarumwas isolated from the fermentation process of the Sichuan Tibetan plateau Chardonnay Ice grape slag and identified using 18S rDNA D1/D2.The formula of different protective agents was optimized by orthogonal experiments,and the spray drying conditions were studied by single factor experiment.The results showed that the optimal formula of protective agents for spray drying was skim milk powder 7%, yeast extract powder 5%,lactose 0.6%,and xanthan gum 0.20%.The viable count was 2.6×1010CFU/g.The optimal spray drying conditions were inlet temperature 120℃,injective flow rate 20 ml/h,proportion of protective agent and cell 4∶1(g∶L).The viable number ofH.uvarumprepared by spray drying was 2.4×108CFU/g.

spray dying;fermentation starter;protective agent

TS261.1

A

0254-5071（2015）06-0062-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.014

2015-05-06

四川省科技支撐計劃項目（2011SZ0284，2012SZ0117，13KCBZ0066）；2012年西華大學食品生物技術重點實驗室開放研究基金資助項目（SZjj2012-005）

蔣麗（1989-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。

*通訊作者：車振明（1960-），男，教授，本科，研究方向為食品發酵技術。