醬渣蛋白提取方法與工藝優化的研究

舒冬梅，王德良，宋緒磊，靳 偉，尚 柯

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.中國食品發酵工業研究院，北京100015；3.新疆農業大學機械交通學院，新疆烏魯木齊830052）

醬渣蛋白提取方法與工藝優化的研究

舒冬梅1，王德良2*，宋緒磊2，靳 偉3，尚 柯1

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.中國食品發酵工業研究院，北京100015；3.新疆農業大學機械交通學院，新疆烏魯木齊830052）

為了回收利用醬渣資源，本實驗探索醬渣蛋白質提取方法，優化提取工藝條件。結果表明，響應面法對超聲輔助提取醬渣蛋白的優化工藝條件為超聲功率365 W，料液比1∶37(g∶mL)，提取液pH值9.8，超聲時間50 min。在此最佳提取工藝條件下，醬渣蛋白的提取率為73.69%。

醬渣；蛋白質；提取方法；工藝優化

醬油起源于中國，是一種傳統且美味的調味劑，在中國的發展至少有2 500年的歷程，公元17世紀經過文化的傳播流入日本[1]。醬油生產的主要原料是脫脂大豆、豆粕、麩皮與面粉。醬渣也稱醬油渣，是指釀造醬油的過程中產生的含水固體殘渣[2]。由于醬渣難于運輸和儲藏，醬油釀造廠通常沒有通過合理回收便低價出售到市場以作肥料或飼料，有的甚至丟棄，造成環境污染和資源的嚴重浪費[3]。據相關部門統計，2013年我國醬油年產量達750萬t，而且其產量規模每年以10%的速度遞增[4]。依據生產1 kg醬油將會產生0.67 kg醬油渣（含水分75%）計算，2014年我國生產825萬t醬油，約產生550萬t醬渣[5]。醬渣呈深棕色，其中主要成分有粗蛋白質含量約30%[6]，粗脂肪約9.7%，植物粗纖維約13.5%，灰分10.5%，另外，醬渣還含具多種生理活性的天然營養因子—異黃酮[7]。陳恩贊等[8]采用微波法提取醬油廢渣中的總異黃酮，醬渣總異黃酮浸出率達到90%以上。高獻禮等[9]用丙酮沉淀方法提取醬油渣蛋白進行分離、鑒定。SHARMA P C等[10]用堿提酸沉法提取杏仁中的蛋白，料液比1∶20，堿提pH 8.0，酸沉pH值4.0，結果杏仁蛋白提取率為71.3%。馬秀婷等[11]采用超聲波輔助提提豆渣中蛋白，最佳工藝為溫度51.0～53.4℃，超聲時間28.8～30.7 min，功率398.1～399.3 W，最終蛋白提取率達到80.19%。國內外對蛋白提取方法主要集中在堿提酸沉法、超聲輔助堿提法、硫酸銨沉淀法、丙酮提取等方面，但是對于醬渣蛋白的提取方法的探究較少。本研究采用不同方法對醬渣蛋白進行提取和對比，并運用超聲波輔助堿提法對醬渣提取工藝進行優化，為更好的開發利用醬渣資源提供參考，同時也為進一步研究醬渣蛋白性質提供前期理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬渣：中國食品發酵工業研究院提供；氫氧化鈉、硼酸、硫酸鉀：北京化工廠；鹽酸：天津市化學試劑一廠；硫酸銅、硫酸：國藥集團化學試劑（北京）有限公司；Novozyme堿性蛋白酶（200000U/g）、Novozyme纖維素酶（22500U/g）：上海碧萊清生物科技有限公司；三氯乙酸：上海宏瑞化工有限公司；丙酮：濟寧華凱樹脂有限公司。所有化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FW80型高速萬能粉碎機：上海科恒實業發展有限公司；XPE105分析天平：METTER TOLEDO公司；DF204型鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；LR10-2.4A型高速冷凍離心機：北京雷勃爾醫療器械有限公司；PHS-3C型pH計、HH-5Y11-Hiz恒溫水浴鍋：上海儀電科學儀器股份有限公司；ELECTROLUX超聲波萃取儀：北京弘祥隆生物技術公司；BCD-251e型冰箱：ELECTROlux（中國）電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同方法提取醬渣蛋白質

醬渣在40℃條件下烘干至質量恒定，用高速萬能粉碎機粉碎，經過40目篩過濾后進行蛋白提取。具體方法如下：

（1）鹽提法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入0.3 mol/L氯化鈉溶液，在55℃的水浴鍋中浸提4 h。

（2）磷酸緩沖液提取法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入磷酸緩沖液（pH9.5，濃度0.05mol/L，其中含2 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、0.1 mol/L KCl），4℃冰箱內浸提4 h。

（3）超聲波輔助堿提酸沉法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入蒸餾水，并用1 mol/L NaOH，調節混合液pH 9.5，超聲溫度為55℃，超聲時間為35 min，超聲功率為400 W。

（4）堿性蛋白酶提取法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入蒸餾水，調節混合液pH 9.5，置于55℃水浴中，加入醬渣質量1%蛋白酶，浸提4 h后80℃水浴滅酶20 min。

（5）堿提酸沉法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入蒸餾水，調pH值至9.5，置于55℃的水浴中浸提4 h。

（6）水提法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入蒸餾水，置于55℃水浴，浸提4 h。

（7）三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-丙酮法[12]：取醬渣粉3 g，加入預冷的10 mL三氯乙酸（TCA）-丙酮溶液（含體積分數10%TCA、0.07%β-巰基乙醇），充分混勻后，在-20℃靜置1 h，4℃、8 000 r/min條件下離心15 min。去上清液的沉淀用預冷的丙酮（-20℃，含0.07%β-巰基乙醇）懸浮，在-20℃冰箱內浸提過夜。在4℃、8 000 r/min條件下離心10 min，去上清液留沉淀，再加入經預冷的丙酮進行浸提，1 h后相同條件離心，棄上清液，收集沉淀。

（8）纖維素酶法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入蒸餾水，調節混合液pH 9.5，置于55℃水浴中，加入醬渣質量1%的纖維素酶，浸提4 h后80℃水浴滅酶20 min。

（9）混合酶法：按照料液比1∶30（g∶mL）加入蒸餾水，調節混合液pH9.5，置于55℃水浴中，加入醬渣質量1%的堿性蛋白酶和纖維素酶，浸提4 h后80℃水浴滅酶20 min。

按照上述的條件處理后，在4℃、8 000 r/min條件下離心15 min，保留上清液；將沉淀用蒸餾水洗滌后再相同條件離心，取兩次上清液混合均勻調pH值至4.5，在45℃水浴30 min，離心（三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-丙酮法除外）。沉淀經真空冷凍干燥即為醬渣蛋白質粗提物，計算醬渣蛋白質提取率，其計算公式如下：

式中：A為提取的蛋白質質量，g；B為醬渣蛋白質總質量，g。

1.3.2 單因素試驗設計

采用超聲輔助堿提法，對各影響因素進行單因素試驗，研究超聲功率、超聲時間、料液比和提取液pH值對醬渣蛋白提取率的影響。

1.3.3 響應面法試驗設計

根據單因素試驗結果，利用響應面優化原理[13]，以醬渣蛋白提取率（Y）為響應值，采用Design-Export軟件中Box-Behnken試驗對醬渣蛋白提取工藝進行優化，Box-Behnken試驗設計的因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 不同方法的醬渣蛋白提取率

由圖1可知，醬渣蛋白提取方法不同，醬渣蛋白的提取率有很大差異，各種酶法提取的醬渣蛋白提取率高（堿性蛋白酶75.46%，纖維素酶65.98%，混合酶73.15%），TCA-丙酮法75.24%、超聲波輔助提取57.67%、堿提酸沉法54.35%等。堿性蛋白酶的提取率最大為75.46%，但是堿性蛋白酶本身是蛋白，對醬渣蛋白的定性和定量檢測會造成干擾，纖維素酶和混合酶同理。TCA-丙酮法蛋白提取方法可能引起蛋白質變性。綜合分析，超聲輔助提取運用超聲波的空化效應，并且結合堿提酸沉法更加方便快捷，蛋白提取率可以達到57.67%，說明該方法可行，以下單因素試驗均采用超聲波輔助堿提酸沉法。

2.2 提取工藝優化單因素試驗

2.2.1 超聲波功率對醬渣蛋白質提取率的影響

稱取2 g醬渣，料液比1∶30（g∶mL）、超聲時間40 min、提取液pH值為9，分別在超聲功率0、200 W、250 W、300 W、350 W、400 W條件下提取。蛋白質提取液經離心后取上清液調pH值至4.5，在45℃水浴離心30 min，沉淀經真空冷凍干燥，考察不同的超聲功率對醬渣蛋白質提取率的影響，結果見圖2。

由圖2可知，超聲功率增大，有利于醬渣蛋白溶出，醬渣蛋白質提取率隨超聲功率增大而提高[14]。雖然超聲功率大，蛋白提取率增加，但是植物蛋白結構在過高超聲功率作用下可能改變，所以選取超聲波功率為350 W來進行超聲波輔助堿提酸沉法提取醬渣蛋白質。

2.2.2 超聲作用時間對提取率的影響

稱取2 g醬渣，在料液比1∶30（g∶mL）、提取液pH值為9，超聲功率350 W條件下，超聲時間分別設定20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min對醬渣蛋白進行提取。提取液經離心后取上清液調pH值至4.5，在45℃水浴離心30 min，沉淀經真空冷凍干燥，考察不同的超聲時間對醬渣蛋白質提取率的影響，結果見圖3。

由圖3可知，超聲輔助堿法提取醬渣蛋白質提取率隨時間增加先提高后稍有降低，時間＜50 min，隨時間延長提取率不斷提高；當時間到達50 min時醬渣蛋白質提取率達到最大值56.7%；時間＞50 min，蛋白質提取率降低。可能由于干燥的醬渣粉與水間需要一定的溶脹時間，足夠的溶脹時間利于蛋白質的分離溶解[15]，但若提取時間過長，則可能有部分蛋白質由于超聲波產生熱量而使出現凝聚沉淀，在后續的離心步驟中隨沉淀被除去，所以超聲時間選50 min為宜。

2.2.3 料液比對醬渣蛋白質提取率的影響

稱取2g醬渣，在超聲功率350W，超聲時間50min，提取液pH值為9，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL）條件下進行醬渣蛋白質提取。提取液經離心后取上清液調pH值至4.5，在45℃水浴離心30 min，沉淀經真空冷凍干燥，考察不同的料液比對醬渣蛋白質提取率的影響，結果見圖4。

由圖4可知，料液比在1∶10～1∶30（g∶mL）范圍內，隨著料液比的提高，醬渣蛋白質提取率提高，但是料液比＞1∶30（g∶mL）以后，蛋白質提取率稍有下降。但是料液比繼續增大時，短時間內醬渣蛋白浸提就達到了飽和，不利于醬渣蛋白的提取。醬渣中水的比例過高也不利于蛋白提取后的沉淀濃縮，綜合考慮，料液比選取1∶30（g∶mL）比較合適。

2.2.4 提取液pH值對醬渣蛋白質提取率的影響

稱取醬渣2 g，在超聲功率350 W，超聲時間為50 min，超聲溫度50℃的條件下，提取液pH值分別為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的條件下進行醬渣蛋白提取。提取液經離心后取上清液調pH值至4.5，在45℃水浴離心30 min，沉淀經真空冷凍干燥，考察不同的提取液pH值對醬渣蛋白質提取率的影響，結果見圖5。

由圖5可知，當提取液pH值為9.5時，蛋白質提取率最大達到62.9%，因為堿性條件下蛋白質發生酸式解離，使其本身帶相同的負電荷而相互排斥，蛋白質在水分子中的分散性增加。同時堿性條件對蛋白質的氫鍵有一定的破壞作用，增加蛋白的親水性。但是堿性過強的環境破壞蛋白質結構和構象，使部分埋藏在蛋白質內部的羧基、酚羥基和巰基離子化甚至失去生物活性[16]。此外，堿性過強的環境會改變蛋白質的營養學特性，生成賴氨酰丙氨酸，這種物質對身體有害毒，引起蛋白營養物質的損失[17]。再者，高堿條件加速美拉德反應引入黑褐色物質，雜質增加，影響蛋白分離純化效果[17]。所以在醬渣蛋白質提取時提取液pH值選取9.5比較適宜。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計與結果分析

根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken的中心組合試驗設計，以超聲功率、料液比、提取液pH值、超聲時間4個因素為自變量，以醬渣蛋白提取率為響應面的目標值，進行4因素3水平共進行29組獨立試驗，其中獨立試驗為24個，0水平重復試驗5個用來估算試驗誤差。Box-Behnken試驗設計及結果見表2。

利用Design-Export對表2試驗數據進行方差及回歸分析，得到醬渣蛋白質提取率對各變量的二次多項回歸模型為：

為了檢驗回歸方程的有效性，對該數學模型進行回歸方差分析顯著性檢驗，結果見表3。

由表3可知，模型P＜0.000 1，回歸模型極顯著。模型的一次項A、B、C、D極顯著，二次項A2、B2、C2、D2極其顯著，交互項AD、BC極顯著，AC、AB、BC、CD不顯著。結果表明，這四種因素對醬渣蛋白提取率的影響并不是簡單的線性關系，失擬項P為0.113 3＞0.05，不顯著，相關系數R2=0.922 8，說明模型的擬合程度較好，此模型可以用來分析和預測超聲波輔助堿法提取醬渣蛋白的提取率。

2.3.2響應面分析與優化

由圖6可知，超聲功率340～370 W，料液比1∶30～1∶38（g∶mL），提取液pH值在9.48～9.85，超聲時間48～54 min時醬渣蛋白提取率＞70%。響應面法對超聲輔助提取醬渣蛋白提取率的優化結果為超聲功率365.08 W，料液比1∶36.59（g∶mL），提取液pH值為9.82，超聲時間51.64 min，在此條件下預測醬渣蛋白提取率為75.55%。

2.3.3 驗證試驗

為了檢驗響應面模型的有效性，實際操作過程中選擇超聲功率365 W，料液比1∶37（g∶mL），提取液pH值為9.8，超聲時間50min，此條件下醬渣蛋白提取率平均值為73.69%，與響應面預測值75.55%相差1.86%，說明響應面優化是可行性，可以通過回歸方程對醬渣蛋白提取率進行預測。

3 結論

響應面法對超聲輔助堿法提取工藝優化結果：超聲功率365 W，料液比1∶37（g∶mL），提取液pH值為9.8，超聲時間50 min，此條件下醬渣蛋白提取率平均值為73.69%。本試驗為醬渣資源的合理開發與利用提供了新思路，為醬渣蛋白的定性和定量分析提供基本原料。

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Extraction methods and process optimization of soy sauce residue protein

SHU Dongmei1,WANG Deliang2*,SONG Xulei2,JIN Wei3,SHANG Ke1
(1.College of Food Science and Medicine,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100015,China; 3.College of Mechanical and Traffic,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

To recycle soy sauce residue resources,extraction method of sauce residue protein was studied,and extraction process conditions were determined.Through response surface methodology,the extraction conditions were optimized as follows:ultrasonic power 365 W,liquid-solid ratio 1∶37(g∶ml),pH 9.8,ultrasonic time 50 min.Under this condition,the protein extraction ratio from soy sauce residue was 73.69%.

soy sauce residue;protein;extraction methods;process optimization

S816.46

A

0254-5071（2015）06-0067-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.015

2015-05-18

科技部院所基金項目（2014EG111217）

舒冬梅（1988-），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

*通訊作者：王德良（1971-），男，教授，博士，研究方向為中國傳統食品發酵工藝的研究。