生活污泥與秸稈混合發酵微生物菌株的篩選及拮抗關系研究

吳金男楊浩深 梁劍光宋廷鴻 馬國勝 尹凡梁先龍 季群

（1常熟理工學院生物與食品工程學院 江蘇常熟 2155002蘇州榮基生態生物科技有限公司 江蘇吳江 215222）

污泥是一種可利用的有機固體廢物，尤其是一種可再生的生物資源。由于污泥中含有大量促進植物生長的有機物質和豐富的氮磷鉀等營養成分以及多種微量元素，因此是重要的有機肥資源和良好的土壤改良劑。污泥堆肥施入土壤后可增加土壤的保水和透氣性，提高土壤的排水能力。但是，我國污泥處置的現狀仍然相當嚴峻，將近90%的生活污泥沒有得到很好的處理，由此造成的污染與二次污染問題也不容忽視[1]。污泥堆制發酵是一種很好的生物處理方式。在微生物的作用下，污泥的臭味可以大大降低并消除其中的有害物質，可以作為土壤的有機肥料或者土壤改良劑，實現廢棄物的無害化和資源化[2-4]。本研究通過對秸稈粉和生活污泥混合堆肥的方法，篩選出有利于污泥堆肥處理的微生物。通過研究他們之間的拮抗關系，為以后采用人工接種的方法進行混合菌群堆肥發酵、實現污泥的無害化處理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生活污泥、秸稈粉，由蘇州榮基生態生物科技有限公司提供。

1.2 培養基

1.2.1 菌株分離及拮抗試驗培養基

牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g，NaCl 5.0g，瓊脂 15～25g，水1000mL，pH 7.4～7.6。

1.2.2 生理生化試驗培養基

耐鹽性試驗培養基：采用牛肉膏蛋白胨液體培養基改變NaCl濃度分別為5%、7.5%、10%、15%。

淀粉水解試驗培養基：在牛肉膏蛋白胨培養基中添加0.2%的可溶性淀粉，按倒平板的要求分裝。

休和利夫森二氏培養基：蛋白胨 2g，NaCl 5g，K2HPO40.2g，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL，1%溴麝香草酚藍水溶液3mL，pH7.0～7.4。

乙酰甲基甲醇試驗培養基：肉汁胨培養液100mL，KNO3lg，pH7.0～7.6。

明膠水解培養基：蛋白胨5g，明膠100～150g，水1000mL，pH 7.2～7.4。

吲哚試驗培養基：蛋白胨 10g，NaCl5g，水 100mL，pH7.2～7.4。

硝酸鹽還原試驗培養基：KNO30.1g，蛋白胨2.5g，蒸餾水500mL，pH7.4。

1.3 方法

1.3.1 堆肥方法

采用靜態通風發酵法堆肥。發酵容器規格為50cm×50cm×100cm。箱體分覆蓋層、物料層、墊料層、接液層四層，由隔離網隔離，接液層有通風氣孔。物料按照秸稈與污泥質量比1:1的比例混合均勻并添加適量麩皮。初始堆料含水率在60%左右，自然發酵至腐熟。

1.3.2 發酵料中細菌的分離純化

取發酵料，用無菌生理鹽水制成懸浮液，懸浮液振蕩30min后靜置5分鐘。取上清液，采用平板劃線法分離菌種，37℃培養48h后挑菌分離并進行3次純化。

1.3.3 菌株初步鑒定

參照相關文獻方法[5-6]，通過菌落的形態、個體形態、生理生化特征等項目的試驗結果進行初步鑒定。

1.3.4 拮抗實驗

采用平板對峙培養法。在保證菌落之間能相遇的距離內，于平板上同時點接不同種微生物菌株，一定條件下培養一段時間后，觀察菌落之間有無拮抗。

2 結果與分析

2.1 結果

2.1.1 菌株分離

發酵15天后，堆肥已腐熟穩定。堆肥表觀指標：堆料呈深棕褐色松散狀，無臭，含水率在40%以下。從發酵料中分離篩選到九個菌株，分別編號為菌株Z1-Z9。

2.1.2 分離菌株的形態

從菌落形態看，Z-1以及Z6～Z9菌株菌落干燥，不透明，表面有褶皺凸起，邊緣呈鋸齒狀，淡黃色。Z-2～Z4菌株菌落較濕潤，不透明，表面光滑平整，邊緣圓整，白色。從革蘭氏染色及鏡檢結果看，9個菌株均為革蘭氏陽性細菌。其中，Z-1、Z-6、Z-7、Z-8、Z-9個體形態比較相似，呈短鏈狀排列，有芽孢，芽孢中生或近中生。Z-2菌桿狀比其他菌稍長，有芽孢，呈長鏈狀排列。Z-3、Z-4、Z-5呈短桿狀，芽孢中生或近中生。

2.1.3 分離菌株的生理生化特征

耐鹽性試驗表明，9個菌株在5%和7.5%NaCl培養基中均生長良好；當鹽濃度達到10%以上時，Z-1、Z6和Z-8能生長，其它菌生長不良。

耐溫性試驗表明，，50℃下9種菌都能很好的生長；60℃時，Z-1、Z6和Z-8能生長，其它菌生長不良。

根據個體形態、菌落特征、革蘭氏染色結果和生理生化特征，初步鑒定，Z-1、Z-6和Z-8為地衣芽孢桿菌，Z-7和Z-9為蠟狀芽孢桿菌，Z-2為類芽孢桿菌屬細菌、Z-3、Z-4和Z-5三個菌株為芽孢桿菌屬的細菌。

2.2 拮抗試驗結果

拮抗是微生物在其生長過程中所產生的代謝產物對周圍環境其它微生物所產生的抑制作用，若微生物之間存在拮抗關系，則必須消除其拮抗作用后才能混合培養。

拮抗試驗表明，Z-1、Z-6、Z-7、Z-8、Z-9細菌完全互不拮抗，Z-2、Z-3、Z-4、Z-5菌也完全互不拮抗；而上述兩組細菌之間拮抗關系不明顯，基本無拮抗。

2.3 分析討論

結合菌落形態、個體形態、革蘭氏染色和生理生化試驗結果，參照《常見細菌系統鑒定手冊》和《一般細菌常用鑒定方法》，可初步鑒定出9個菌株均為芽孢桿菌，分屬芽孢桿菌屬和類芽孢桿菌屬。拮抗試驗表明，9個菌株之間基本沒有拮抗關系。本試驗為下一步通過這些菌的混合培養制作混合微生物菌劑作為生活污泥與秸稈發酵的發酵劑為提供了依據。

[1]張辰.污水處理廠污泥處理處置技術政策解讀與污泥產業“十二五”展望[J].水工業市場,2010(4）:23-27.

[2]李國學,張福鎖．固體廢物堆肥化與有機復合肥生產[M].北京：化學工業出版社,2000．