Fas及Fas-L對小梁切除術(shù)后成纖維細(xì)胞的凋亡研究*

黎宗漢譚思敏柯 毅彭紅娟

Fas及Fas-L對小梁切除術(shù)后成纖維細(xì)胞的凋亡研究*

黎宗漢①譚思敏①柯 毅①彭紅娟①

目的：探討Fas及Fas-L對小梁切除術(shù)后成纖維細(xì)胞凋亡的影響。方法：選取健康白兔20只，隨機(jī)分為對照組和觀察組，每組各10只，分別切下兩組白兔帶結(jié)膜、筋膜、鞏膜及角膜緣的濾過手術(shù)區(qū)組織，進(jìn)行成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，其中觀察組進(jìn)行青光眼小梁切除術(shù)。隨機(jī)選取兩組中各5例成纖維細(xì)胞進(jìn)行FasMcAb處理，使用PI染色、流式細(xì)胞儀檢測所有細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：經(jīng)FasMcAb處理的正常成纖維細(xì)胞凋亡率遠(yuǎn)高于未經(jīng)FasMcAb處理的正常成纖維細(xì)胞，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)FasMcAb處理的青光眼小梁切除術(shù)濾過區(qū)組織成纖維細(xì)胞凋亡率遠(yuǎn)高于未經(jīng)FasMcAb處理的青光眼小梁切除術(shù)濾過區(qū)組織成纖維細(xì)胞，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；經(jīng)FasMcAb處理的青光眼小梁切除術(shù)濾過區(qū)組織成纖維細(xì)胞凋亡率大于正常成纖維細(xì)胞，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：Fas/Fas-L能夠加速小梁切除術(shù)后成纖維細(xì)胞凋亡，可為減少青光眼小梁切除術(shù)后瘢痕化尋找一個新的突破口。

Fas； FasMcAb； 小梁切除術(shù)； 成纖維細(xì)胞； 凋亡

青光眼是全球主要的不可逆性的致盲性眼病之一，居第2位，是世界防盲治盲的重點工作之一[1]。盡管治療青光眼上出現(xiàn)了新的技術(shù)和技術(shù)改進(jìn)，小梁切除術(shù)仍然是最主要的治療方式，但其遠(yuǎn)期手術(shù)成功率并不理想，濾過泡瘢痕化是小梁切除術(shù)失敗的重要原因[2]。為了解決濾過泡瘢痕化的問題，人們通過使用抗代謝藥物、基因治療、激光微創(chuàng)治療、生物合成材料等方法，但均未得到滿意效果[3-4]。臨床常用的抗代謝藥物及抗細(xì)胞增殖藥物5-氟尿嘧啶及絲裂霉素等在應(yīng)用于手術(shù)很大程度上提高了手術(shù)成功率。但由于使用此類藥物導(dǎo)致的如角膜損害、濾過泡滲漏、眼內(nèi)感染、黃斑水腫等并發(fā)癥的發(fā)生率也相應(yīng)增加，將會給患者帶來新的威脅，再次手術(shù)療效欠佳，且明顯增加了患者心理、經(jīng)濟(jì)的負(fù)擔(dān)[5-7]。

Fas介導(dǎo)的凋亡被認(rèn)為是介導(dǎo)死亡信號傳遞的主要通道，F(xiàn)as及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的異常參與了多種疾病的發(fā)病過程，近來引起眾多學(xué)者的重視[8-9]。本研究對Fas/Fas-L在小梁切除術(shù)后對成纖維細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行探討，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取廣東雙林生物制藥有限公司的健康白兔20只，隨機(jī)分為對照組和觀察組，每組各10只，分別切下兩組白兔帶結(jié)膜、筋膜、鞏膜及角膜緣的濾過手術(shù)區(qū)組織，進(jìn)行成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，其中觀察組進(jìn)行青光眼小梁切除術(shù)。隨機(jī)選取兩組中各5例成纖維細(xì)胞進(jìn)行FasMcAb處理，共分為四組，分別為正常細(xì)胞對照組、正常細(xì)胞+FasMcAb組、青光眼小梁切除術(shù)濾過區(qū)組織組及青光眼小梁切除術(shù)濾過區(qū)組織+FasMcAb組。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基為Gibco BRL公司產(chǎn)品，胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品，碘化丙啶（PI）、RNase A為Sigma公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀及FasMcAb（IgM型，7C11表位）為Beckman-Coulter公司產(chǎn)品。

1.3 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 切除所有標(biāo)本的表皮和皮下組織后在少量牛血清中切成1 mm3大小的組織塊，并將其存入培養(yǎng)瓶中。在37 ℃，5％ CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)4～6 h，然后加入適量的DMEM培養(yǎng)基（含15％胎牛血清），3～4 d換液1次，2～3周后，至細(xì)胞長滿并且匯合成片，消化于0.25％胰蛋白酶中，按1∶2～3的比例傳代培養(yǎng)。此后每2～3 d換液1次，每3～5 d傳代1次，實驗用第8～10代細(xì)胞。

1.4 PI染色、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 分別取四組中處于指數(shù)生長狀態(tài)下的細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（1×105個/孔），兩組FasMcAb處理組分別加入FasMcAb至濃度為100 ng/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，至細(xì)胞密集長滿孔底。消化細(xì)胞后以1000 r/min離心10 min，使用預(yù)冷PBS洗1遍，加入70％純度的乙醇，于4 ℃固定過夜。過夜后低速離心10 min，PBS洗滌后，向剩余的0.5 mL細(xì)胞懸液加入RNase A 2 mL（20 g/L），37 ℃孵育0.5 h后快速投入冰水浴中停止RNase A作用，此時加入500 mL PI染液（100 mg/L）避光孵育0.5 h，經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾，使用流式細(xì)胞儀對所有成纖維細(xì)胞進(jìn)行DNA分析，比較細(xì)胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 本文研究數(shù)據(jù)均采取SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料采取（±s）表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)FasMcAb處理的正常成纖維細(xì)胞凋亡率（17.69±6.38）％遠(yuǎn)高于未經(jīng)FasMcAb處理的正常成纖維細(xì)胞（5.15±1.32）％，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.65，P＜0.01）；經(jīng)FasMcAb處理的青光眼小梁切除術(shù)濾過區(qū)組織成纖維細(xì)胞凋亡率（24.88±7.23）％遠(yuǎn)高于未經(jīng)FasMcAb處理的青光眼小梁切除術(shù)濾過區(qū)組織成纖維細(xì)胞（4.25±0.33）％，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.25，P＜0.01）；非FasMcAb處理，正常成纖維細(xì)胞的凋亡率（5.15±1.32）％高于青光眼小梁切除術(shù)濾過區(qū)組織成纖維細(xì)胞的凋亡率（4.25±0.33）％，兩組比較差異具無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.23，P＜0.05）；而經(jīng)FasMcAb處理后，青光眼小梁切除術(shù)濾過區(qū)組織成纖維細(xì)胞的凋亡率（24.88±7.23）％高于正常纖維細(xì)胞的凋亡率（17.69±6.38）％，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.94，P＜0.01）?？梢奆asMcAb的確能夠加速成纖維細(xì)胞的凋亡，并且對濾過區(qū)組織成纖維細(xì)胞凋亡影響大于正常成纖維細(xì)胞。

3 討論

青光眼是指眼內(nèi)壓間斷或持續(xù)升高的一種眼病，持續(xù)的高眼壓可以給眼球各部分組織和視功能帶來損害，如不及時治療，視野可以全部喪失而至失明[10]。依據(jù)世界衛(wèi)生組織資料推測，全球僅原發(fā)性青光眼患者就有6680萬，而且患者逐年增加，我國僅原發(fā)性青光眼的患病率就達(dá)0.52％，50歲以上人群為2.07％，該病已成為嚴(yán)重影響我國人民身心健康和國民經(jīng)濟(jì)、社會發(fā)展和穩(wěn)定的主要疾病之一[9]。目前小梁切除術(shù)仍是治療青光眼的重要手段。但術(shù)后濾過泡易發(fā)生纖維瘢痕化，導(dǎo)致濾過功能喪失，使眼壓再次升高，手術(shù)失敗。濾過泡瘢痕化的機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為可能主要與除結(jié)膜成纖維細(xì)胞過度增生、凋亡受阻有關(guān)，隨著細(xì)胞凋亡在各領(lǐng)域內(nèi)研究的進(jìn)展，這種受基因調(diào)控的程序性的細(xì)胞死亡，在瘢痕研究領(lǐng)域也越來越受到重視。

細(xì)胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，而Fas/Fas-L途徑是激活細(xì)胞凋亡的重要途徑[11]。Fas又稱CD95，是腫瘤壞死因子受體之一，是一種由325個氨基酸組成的跨膜蛋白受體分子。若Fas和配體Fas-L結(jié)合，F(xiàn)as分子可啟動致死性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而引起細(xì)胞的多種特征性變化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前，對兩者的研究已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一，研究發(fā)現(xiàn)Fas廣泛表達(dá)于成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等細(xì)胞表面，F(xiàn)as-L主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞，也表達(dá)在睪丸、眼等免疫豁免部位[12-14]。Fas/Fas-L途徑作為細(xì)胞凋亡激活途徑，其表達(dá)水平的變化會導(dǎo)致一系列病理改變，F(xiàn)as/Fas-L促進(jìn)小梁切除術(shù)后成纖維細(xì)胞凋亡存在一定可行性[15]。然而目前國內(nèi)外對濾過泡瘢痕組織的研究主要集中在成纖維細(xì)胞的增值影響因素及調(diào)節(jié)信號，對其凋亡的主要影響因子Fas/Fas-L的表達(dá)及意義的了解甚少。

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)無論正常成纖維細(xì)胞或是青光眼小梁切除術(shù)濾過區(qū)組織成纖維細(xì)胞經(jīng)FasMcAb處理后，其凋亡率顯著增加，且FasMcAb對青光眼小梁切除術(shù)濾過區(qū)組織成纖維細(xì)胞的影響比正常成纖維細(xì)胞顯著。Fas/Fas-L信號通路為調(diào)控傷口愈合與瘢痕形成的平衡提供可能，能夠達(dá)到預(yù)防和治療濾過泡瘢痕化的目的。

綜上所述，F(xiàn)as/Fas-L對小梁切除術(shù)后成纖維細(xì)胞凋亡影響顯著，能夠加快細(xì)胞凋亡，可為減少青光眼小梁切除術(shù)后瘢痕化尋找一個新的突破口，為尋找一種更加安全、特異、有效的抗瘢痕化方法提供新思路。

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Research on Apoptosis of the Fibroblast Induced by Fas and Fas-L after Trabeculectomy/

LI Zong-han，TAN Si-min，KE Yi，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（10）：018-020

Objective： To explore apoptosis of the fibroblast induced by Fas and Fas-L after trabeculectomy. Method： A total of 20 healthy white rabbits were randomly divided into the control group and observation group，10 cases in each group，and the rabbits in the observation group were given glaucoma trabeculectomy.Two groups of tissues in trabeculectomy filtration area， which contain conjunctiva， anadesma， sclera and limbus corneae were cut down， and the fibroblasts of the tissues were cultivated. 5 cases of fibroblasts in each group were randomly selected and treated by FasMcAb. At last， PI staining and flow cytometry were used for testing the apoptotic rate of all the fibroblasts.Result： The apoptotic rate of normal fibroblasts induced by FasMcAb was higher than that of normal fibroblasts without induced by FasMcAb， the difference was statistically significant（P＜0.01）； the apoptotic rate of fibroblasts from tissues in trabeculectomy filtration area induced by FasMcAb was higher than that of fibroblasts from tissues in trabeculectomy filtration area without induced by FasMcAb，the difference was statistically significant（P＜0.01）；the effect of FasMcAb on the apoptotic rate of fibroblasts from tissues in trabeculectomy filtration area was more significant than that on normal fibroblasts， the difference was statistically significant（P＜0.01）.Conclusion：Fas/Fas-L can accelerate apoptosis of the fibroblast after trabeculectomy， and helps to find a new breakthrough to reduce the scar after glaucoma trabeculectomy.

Fas； FasMcAb； Trabeculectomy； Fibroblast； Apoptosis

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.10.006

2014-12-26） （本文編輯：周亞杰）

湛江市科技計劃項目資助（2012C3103036）

①廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 廣東 湛江 524001

黎宗漢

First-author’s address：Guangdong Medical College Affiliated Hospital，Zhanjiang 524001，China