非小細胞肺癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織CEA、ERCC-1表達及臨床意義

張文，顧劍玲，馮穎，王曉芳，李鵬

(1中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，北京100048；2天津市職業(yè)病防治院)

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非小細胞肺癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織CEA、ERCC-1表達及臨床意義

張文1，顧劍玲2，馮穎2，王曉芳2，李鵬2

(1中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院，北京100048；2天津市職業(yè)病防治院)

摘要：目的比較非小細胞肺癌(NSCLC)原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織癌胚抗原(CEA)、切除修復交叉互補基因1(ERCC-1)表達的差異，并探討其意義。方法選擇NSCLC患者90例， TNM Ⅰ期19例、Ⅱ期26例、Ⅲ期29例、Ⅳ期16例。收集患者的原發(fā)灶及Ⅲ期患者的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織，檢測CEA、ERCC-1 mRNA及其蛋白表達。結(jié)果隨著TNM分期增高，NSCLC患者原發(fā)灶組織CEA、ERCC-1 mRNA及其蛋白表達逐漸升高(P均<0.05)。TNM Ⅲ期患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織CEA、ERCC-1 mRNA及其蛋白表達高于原發(fā)灶組織(P均<0.05)。結(jié)論NSCLC原發(fā)灶組織CEA、ERCC-1表達隨TNM分期增高而升高，TNM Ⅲ期患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織CEA、ERCC-1表達高于原發(fā)灶，CEA、ERCC-1高表達可能是肺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子途徑。

關(guān)鍵詞：非小細胞肺癌；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；癌胚抗原；切除修復交叉互補基因1

非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常見的病理類型，臨床主要采用手術(shù)切除、化療、生物靶向藥物等治療，但部分患者預后不佳，仍會出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移[1]。部分NSCLC患者經(jīng)化療、生物靶向藥物治療后，原發(fā)病灶縮小，但轉(zhuǎn)移灶可繼續(xù)增大，為NSCLC患者預后不佳的關(guān)鍵因素[2]。癌胚抗原(CEA)是目前應(yīng)用最廣泛的腫瘤標記分子，而切除修復交叉互補基因1(ERCC-1)與NSCLC預后及化療耐藥等密切相關(guān)。本研究分析NSCLC原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織CEA、ERCC-1表達的差異，旨在探討NSCLC遠處轉(zhuǎn)移的分子機制，進而為臨床制定治療措施提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇2012年5月～2014年6月天津市職業(yè)病防治院收治的NSCLC患者90例，均經(jīng)組織病理學檢查明確診斷。排除標準：①術(shù)后病理診斷為小細胞肺癌者；②術(shù)前接受放、化療者；③合并呼吸衰竭、心功能不全及腎功能不全者。TNM Ⅰ期19例，男12例、女7例，年齡(62.12±6.54)歲，BMI(21.65±3.12)kg/m2，病理類型：腺癌8例、鱗癌6例、腺鱗癌3例、大細胞癌2例； Ⅱ期26例，男17例、女9例，年齡(61.85±6.42)歲，BMI(22.03±2.85)kg/m2，病理類型：腺癌12例、鱗癌7例、腺鱗癌5例、大細胞癌2例； Ⅲ期29例，男18例、女11例，年齡(61.77±6.35)歲，BMI(22.12±3.12)kg/m2，病理類型：腺癌12例、鱗癌11例、腺鱗癌4例、大細胞癌2例；Ⅳ期16例，男10例、女6例，年齡(62.18±6.42)歲，BMI(21.76±3.24)kg/m2，病理類型：腺癌7例、鱗癌6例、腺鱗癌2例、大細胞癌1例。各TNM分期患者性別、年齡、BMI、病理類型具有可比性。

1.2樣本采集TNM Ⅰ～Ⅲ期患者手術(shù)切除原發(fā)病灶，收集肺癌組織，Ⅳ期患者收集肺穿刺病灶組織，液氮迅速冷凍后-80 ℃保存；同時收集Ⅲ期患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)活檢組織，用生理鹽水清洗，洗盡組織表面殘留血液后，用吸水紙吸盡組織水分，液氮迅速冷凍組織，-80 ℃保存。所有肺癌組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織均經(jīng)病理檢查確認有癌細胞浸潤。

1.3原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織CEA、ERCC-1表達檢測

1.3.1CEA、ERCC-1 mRNA表達檢測引物設(shè)計與合成：參照高文斌等[3]的方法進行設(shè)計，包括上游與下游擴增引物序列與片段長度。CEA、ERCC-1 mRNA檢測：采用RT-PCR法。根據(jù)設(shè)計引物序列，TRIzol試劑抽提組織總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成cRNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：42 ℃、30 min，95 ℃、2 min。得到cRNA標本后，按照合適比例稀釋樣本后進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃變性25 s，56 ℃退火35 s，72 ℃復性65 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。收集PCR產(chǎn)物，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射儀下得到DNA條帶，拍照記錄后輸入，對條帶的熒光度進行測定，計算CEA、ERCC-1 mRNA表達量。

1.3.2CEA、ERCC-1蛋白表達檢測參照試劑盒說明書提取總蛋白：原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織經(jīng)生理鹽水沖洗2次后充分剪碎，加入蛋白裂解液14 000 r/min離心5 min，取上清5 μL加去離子水95 μL、考馬斯亮3 μL，于595 nm處測量OD值。蛋白電泳與轉(zhuǎn)膜：樣品(煮沸5 min、冷卻后取50 μg)、電泳(12%濃縮膠：90 V+30 min；10%分離膠：120 V+120 min)、轉(zhuǎn)膠(70 V+120 min)、脫脂漂洗(5%脫脂奶粉TBST溶液封閉抗體，TBS漂洗5 min×3次)。抗體孵育與染色：一抗孵育，4 ℃過夜；二抗孵育，37 ℃、1 h；曝光2 min，顯影后獲得CEA、ERCC-1對應(yīng)的蛋白條帶，用軟件讀取蛋白條帶的灰度值，計算蛋白表達量[4]。

2結(jié)果

2.1不同TNM分期NSCLC患者原發(fā)灶組織CEA、ERCC-1表達比較見表1。

表1　不同TNM分期NSCLC患者原發(fā)灶組織CEA、ERCC-1表達比較

注：與Ⅰ期比較，*P<0.05；與Ⅱ期比較，#P<0.05；與Ⅲ期比較，△P<0.05。

2.2TNMⅢ期NSCLC患者原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織CEA、ERCC-1表達比較見表2。

表2　TNM Ⅲ期NSCLC患者肺癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織CEA、ERCC-1表達比較

注：與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織比較，*P<0.05。

3討論

NSCLC是肺癌最常見的病理類型，占所有肺癌的80%～90%[5]。隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，NSCLC患者的預后得到極大改善[6]。含鉑類藥物的化療方案是治療NSCLC的標準方案，輔助以吉非替尼等生物靶向藥物或中醫(yī)藥物，可最大限度地殺滅腫瘤細胞、預防腫瘤復發(fā)，進而延長患者的生存時間[7]。但仍有部分患者在接受綜合治療措施后預后情況不佳，主要原因是綜合治療后發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[8]。研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)后化療或生物治療過程中原發(fā)腫瘤的生長雖然受到了明顯抑制，但轉(zhuǎn)移灶卻無明顯變化，甚至繼續(xù)增大。腫瘤原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶對治療藥物敏感性不一致是影響治療效果和預后的主要因素。鑒于經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NSCLC最常見的轉(zhuǎn)移方式[9]，因此探尋原發(fā)灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中差異表達的基因能夠為制定針對轉(zhuǎn)移病灶的治療方案提供參考和依據(jù)。

CEA是一類酸性糖蛋白，來自柱狀上皮細胞，是目前應(yīng)用最廣泛的腫瘤標記分子[10]。正常成人血清中很難測出CEA，當氣道鱗狀上皮細胞發(fā)生癌變時會大量合成CEA，血清CEA水平與腫瘤直徑、是否轉(zhuǎn)移有一定相關(guān)性[6]，對于腫瘤術(shù)后復發(fā)的診斷敏感性達80%以上[11]。ERCC-1是由297個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，主要參與DNA雙鏈的切割以及損傷修復的過程[12]。由ERCC-1編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)能夠與DNA修復酶缺乏互補基因F(XPF)形成異源二聚體ERCC1-XPF，進而識別DNA的損傷片段并對5′末端進行切除[9]。研究表明，當ERCC1表達增強時，能夠使順鉑化療后產(chǎn)生的DNA絡(luò)合物被迅速清除，使停滯在G2/M期損傷的DNA迅速修復，進而導致順鉑耐藥[8]。因此，我們推測CEA、ERCC-1異常表達與肺癌的發(fā)生和病情的發(fā)展有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，隨著TNM分期升高，肺癌組織中CEA、ERCC-1表達越高，與朱建榮等[13]報道類似，表明CEA、ERCC-1過度表達與NSCLC的發(fā)生密切相關(guān)，CEA、ERCC-1表達越高，TNM分期越差。晚期肺癌患者遠處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率較高，但造成癌細胞轉(zhuǎn)移的分子機制尚未闡明。本研究結(jié)果顯示，TNM Ⅲ期患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織CEA、ERCC-1表達明顯高于原發(fā)灶組織，表明CEA、ERCC-1高表達與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上所述，NSCLC原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中CEA、ERCC-1表達存在差異；CEA、ERCC-1高表達可能是NSCLL淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在分子機制。本研究結(jié)果可為NSCLC的診治提供新思路。

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收稿日期：(2015-05-14)

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2015)48-0072-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.48.027

基金項目：吳階平醫(yī)學基金會資助項目(320.6750.12199)。