野生小鼠來源1號(hào)染色體替換系小鼠的生長表型與血液生化檢測(cè)

高遄，徐偉，徐福意，張耀奇，趙瑩，趙麗亞，周宇荀，李凱* ，肖君華

(1.東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620;2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203)

由于與人類在遺傳、生理和生化方面驚人的相似度，小鼠作為模式生物來研究決定生理性狀的基因頗具歷史［1］。數(shù)以千計(jì)的數(shù)量性狀基因座(quantitative trait loci，QTL)已經(jīng)在小鼠基因組上被定位，主要使用經(jīng)典的同源導(dǎo)入近交系法［2］。由于該法受限于已有近交系小鼠群體的低分辨率QTL 定位精度［3，4］，Nadeau 等［5－10］在2000年左右提出的染色體替換系群體加速了QTL 的定位與基因發(fā)現(xiàn)研究。染色體替換系群體是將供體品系中一根完整的染色體通過回交方式轉(zhuǎn)入到受體品系的基因背景中，再通過回交的方式使得99%以上的基因背景與受體品系完全相同［5，10，11］。由于排除了基因的相互作用以及多重QTL 的共分離作用，在染色體替換系群體中觀察到的表型差異往往比不同品系間的差異更明顯［9－11］。

早期的染色體替換系群體，多將一近交系的染色體替換至另一近交系小鼠，如A/J 和B6 之間的染色體替換群體對(duì)焦慮表型的QTL 研究［12］，以及通過MSM 小鼠與B6 替換系群體定位代謝相關(guān)QTL［10］。然而，經(jīng)典近交系小鼠的染色體替換系群體與自然群體相比QTL 的數(shù)量非常有限，從而影響表型的差異以及基因座的發(fā)現(xiàn)［13］。研究發(fā)現(xiàn)野生小鼠群體與實(shí)驗(yàn)室近交系小鼠相比具有更為廣泛的連鎖不平衡和更多的等位基因，這些發(fā)現(xiàn)使得野生小鼠成為發(fā)掘QTL 的更為理想的模式生物［2，14，15］。

本課題組自2007年起，開始收集中國野生小家鼠資源，并培育1 號(hào)染色體替換群體。迄今已累計(jì)回交7 代以上，并已近親交配2 代以上。本文就其中9 個(gè)野生小家鼠1 號(hào)染色體替換系的體重、體長。尾長變化等生長發(fā)育特性與內(nèi)臟器官重量和血液生化指標(biāo)進(jìn)行了一系列測(cè)定，以分析其性狀異同。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本課題組培育的9 個(gè)染色體替換品系小鼠:B6-Chr1CM(簡稱CM)，B6-Chr1HZ(簡稱HZ)，B6-Chr1KM(簡 稱KM)，B6-Chr1SJ3(簡 稱SJ3)，B6-Chr1SMX(簡稱SMX)，B6-Chr1TW(簡稱TW)，B6-Chr1ZC(簡 稱ZC)，B6-Chr1ZZ1(簡 稱ZZ1)，B6-Chr1ZZ2(簡稱ZZ2)。對(duì)照組C57BL/6 小鼠(簡稱B6)，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK(滬)2012-0002］。飼料為上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司生產(chǎn)的大小鼠高壓飼料。染色體替換品系小鼠的飼養(yǎng)繁殖實(shí)驗(yàn)在東華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施內(nèi)［SYXK(滬)2014-0022］進(jìn)行。

用于檢測(cè)生長曲線的小鼠每個(gè)品系個(gè)數(shù)和回交、自交代數(shù)見表1。

表1 生長發(fā)育檢測(cè)用小鼠數(shù)量及自交代數(shù)Tab.1 The mice used for growth phenotyping

1.2 主要試劑與儀器

血液生化試劑丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)，低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，總蛋白(TP)，白蛋白(ALB)，堿性磷酸酶(ALP)，甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)，尿酸(UA)，總膽紅素(TB)，葡萄糖(GLU)，肌酐(CRE)均購買自上海科華生物工程股份有限公司。使用上海科華生物工程股份有限公司生產(chǎn)的KHB 卓越310 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)上述指標(biāo)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 體重測(cè)量

各品系分別選取一定數(shù)量的雌性和雄性小鼠(見表1)，由出生第一天起，每2 天測(cè)量一次體重，直至第31 天;由43(第6 周)天開始每周測(cè)量一次體重，直至第85 天(第12 周)。

1.3.2 體長測(cè)量

抓取小鼠后使用直尺測(cè)量小鼠鼻尖到尾巴根部的長度，測(cè)量頻率與體重測(cè)量相同。

1.3.3 尾長測(cè)量

抓取小鼠后使用直尺測(cè)量小鼠尾根到尾尖的長度，測(cè)量頻率與體重測(cè)量相同。

1.3.4 血液生化測(cè)量

取日齡為85d 后的小鼠在采血前14h 隔夜禁食，保留飲用水。采用眼眶靜脈叢采血法，采取血液后放置于4℃冰箱內(nèi)4h 后，3000 r/min 離心10 min，取上層血清保存進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。溶血的樣本丟棄。

1.3.5 器官重量測(cè)量

小鼠在采血后立即使用頸椎脫臼法處死，用75%乙醇浸泡消毒全身后，固定于解剖板上，使用眼科手術(shù)剪與眼科手術(shù)鉗依次摘取心臟、肝臟、肺、脾臟、腎臟、腦部，并稱重。

1.3.6 臟器系數(shù)

器官重量占體重的比例，以百分比形式表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

體重、體長、尾長以出生第1 天、第19 天、第31天和第85 天的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。使用SPSS 20.0 軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，各組數(shù)據(jù)使用t檢驗(yàn)與B6 小鼠的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生長曲線

2.1.1 體重變化

由生長曲線圖(圖1A，B)可知，體重增長速度可分為三個(gè)階段，較快期間為第1 ～19 天，最快期間為19 ～31d，31d 后進(jìn)入平緩增長。故以出生第1、19、31 和85 天作為節(jié)點(diǎn)詳細(xì)分析。

出生第1 天，B6 雌鼠體重最低且與KM(P =0.000)、ZZ1(P =0.014)、TW(P =0.031)的雌鼠具顯著差異;雄鼠中B6 顯著低于KM(P =0.013)。第19 天，KM 雌鼠體重顯著高于B6(P =0.004);SJ3 雄鼠顯著輕于B6(P =0.0265)。第31 天雌鼠中，KM 體重顯著高于B6(P =0.023)，而SJ3(P =0.005)、CM(P =0.010)和HZ(P =0.025)體重顯著低于B6;雌鼠中，KM 體重顯著高于B6(P =0.001)，SJ3(P =0.031)和TW(P =0.044)體重顯著低于B6。第85 天，KM 顯著高于B6(KM 雌P =0.005，KM 雄P =0.000)，以及TW 顯著低于B6(TW 雌P=0.006，TW 雄P =0.001)。所有的替換系小鼠群體中，KM 雌鼠和雄鼠在體重上從出生開始一直高于其他品系小鼠。

圖1 替換系群體小鼠(A.雌鼠;B.雄鼠)體重變化Fig.1 Growth curves of the chromosome substitution mice(A.Females;B.Males)

2.1.2 體長

體長變化如圖2(A，B)所示。第1 ～19 天增長速度最快，19 ～31d 次之，31d 以后最為平緩。

替換系群體的新生鼠與B6 差異無顯著性。第19 天時(shí)僅KM 雌鼠體長顯著大于B6(P =0.002)。第31 天雌鼠中，CM(P =0.001)、SJ3(P =0.001)、HZ(P = 0.013)、SMX(P = 0.028)與ZZ1(P =0.043)5 個(gè)品系的雌鼠體長顯著低于B6;雄鼠中，KM 顯著高于B6 雄鼠(P=0.006)，SJ3 顯著低于B6(P=0.012)。第85 天時(shí)，雌鼠中僅CM 顯著小于B6(P = 0.039);雄鼠中，僅SMX 小于B6(P =0.023)。

2.1.3 尾長

尾長變化如圖3(A，B)所示，曲線趨勢(shì)與體長類似。

圖2 替換系群體小鼠(A.雌鼠;B.雄鼠)體長變化Fig.2 Body length curves of the male chromosome substitution mice(A.Females;B.Males)

新生替換系群體小鼠與B6 差異無顯著性。第19 天，雌鼠中HZ(P = 0.001)、CM(P = 0.001)、SMX(P=0.015)、ZZ2(P =0.028)4 個(gè)品系的尾長顯著低于B6;雄鼠中HZ(P =0.000)、SMX(P =0.000)、SJ3(P =0.000)、CM(P =0.000)、ZZ2(P =0.001)顯著低于B6。第31 天時(shí)，雌鼠中HZ(P =0.001)、SMX(P =0.002)、ZZ2(P =0.005)、CM(P=0.009)顯著短于B6;雄鼠中，SMX(P =0.000)、CM(P=0.000)、HZ(P=0.000)、ZZ2(P =0.000)、SJ3(P=0.001)顯著短于B6。第85 天，雌鼠中KM顯著長于B6 顯著(P =0.012)，而CM(P =0.000)、HZ(P=0.000)、SJ3(P=0.000)、SMX(P =0.000)、TW(P =0.000)、ZC(P =0.001)、ZZ1(P =0.013)、ZZ2(P=0.000)這8 個(gè)品系均低于B6 且差異有顯著性。

2.2 替換系小鼠主要器官臟器系數(shù)

各品系小鼠主要器官的臟器系數(shù)如表2 所示。

圖3 替換系群體小鼠(A.雌鼠;B.雄鼠)尾長變化Fig.3 Tail length curves of the chromosome substitution mice(A.Females;B.Males)

各品系小鼠心臟與B6 差異無顯著性。在肝與肺臟器系數(shù)上，均僅KM 雄鼠顯著低于B6;在脾臟器系數(shù)上，HZ 雌鼠與KM 雄鼠顯著低于B6;在腎臟器系數(shù)上，KM 雄鼠、TW 雌鼠、ZC 雌雄鼠、與ZZ1 雄鼠顯著低于B6，ZZ2 雄鼠顯著高于B6;在腦臟器系數(shù)上，雌鼠中僅KM 低于B6，雄鼠中CM、HZ、KM、SMX、ZZ1 與ZZ2 均顯著低于B6，TW 雄鼠顯著高于B6。

2.3 血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

總計(jì)13 個(gè)指標(biāo)中，ALB、AST、CRE、GLU、UA、TP、HDL 和LDL 等8 個(gè)指標(biāo)與B6 相比差異無顯著性，其余5 個(gè)指標(biāo)中存在替換系小鼠與B6 差異有顯著性(表3)。

ALP 結(jié)果顯示，HZ 雌鼠顯著高于B6(P =0.001);KM 雄鼠顯著低于B6(P =0.031);ALT 結(jié)果顯示，CM 雌鼠顯著高于B6(P =0.011);TB 的結(jié)果顯示，雄鼠中CM(P =0.000)、SMX(P =0.000)與HZ(P =0.041)均顯著高于B6;TG 結(jié)果顯示，SMX 雄鼠顯著高于B6(P =0.044);TC 結(jié)果顯示，TW 雄鼠顯著高于B6(P=0.005)。

表2 臟器系數(shù)Tab.2 Organ coefficients of the mice

表3 替換系群體小鼠與B6 存在顯著差異的血液生化指標(biāo)(±s)Tab.3 Blood biochemical indexes with significant differences between the chromosome substitution strain and B6 mice

表3 替換系群體小鼠與B6 存在顯著差異的血液生化指標(biāo)(±s)Tab.3 Blood biochemical indexes with significant differences between the chromosome substitution strain and B6 mice

品系Strains數(shù)量n性別Sex堿性磷酸酶ALP U/L丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT U/L總膽紅素TB μmol/L甘油三酯TG mmol/L總膽固醇TC mmol/L B6 10 ♀ 89.89 ±26.14 24.3 ±8.63 1.54 ±0.46 0.62 ±0.22 1.99 ±0.36 11 ♂ 70.1 ±24.93 37.91 ±21.71 1.87 ±0.63 1.2 ±0.32 2.41 ±0.42 CM 11 ♀ 84.45 ±26.42 66 ±44.82* 2.65 ±1.72 0.61 ±0.16 1.77 ±0.79 13 ♂ 71.58 ±17.17 46.92 ±29.72 3.68 ±0.64 1.29 ±0.81 2.34 ±0.62 HZ 16 ♀ 126.31 ±35.89* 42.5 ±25.44 2.43 ±0.61 0.88 ±0.32 2.63 ±0.7 10 ♂ 90.56 ±21.08 32.67 ±15.09 3.12 ±1.07* 0.74 ±0.22 2.23 ±0.55 KM 10 ♀ 70 ±33.7 34.6 ±10.17 0.94 ±0.46 0.82 ±0.54 1.37 ±0.86 10 ♂ 48.36 ±26.74* 35.27 ±9.76 1.59 ±0.44 0.97 ±0.42 1.97 ±0.79 SJ3 12 ♀ 81.58 ±21.18 38.67 ±11.23 2.06 ±0.7 0.99 ±0.61 2.35 ±0.51 12 ♂ 59.08 ±24.42 31.75 ±9.83 2.56 ±0.47 1.04 ±0.29 2.45 ±0.75 SMX 14 ♀ 78.79 ±33.96 38.36 ±28.31 1.98 ±0.48 1.29 ±0.9 2.36 ±0.52 9♂ 49.11 ±25.85 47.22 ±31.48 3.31 ±1.26 1.69 ±0.92* 2.92 ±0.81 TW 14 ♀ 104.86 ±34.79 42.21 ±19.92 1.64 ±0.46 0.92 ±0.37 2.9 ±1.06 16 ♂ 73 ±21.38 45.81 ±28.07 2.3 ±0.59 1.24 ±0.42 3.7 ±0.93*ZC 7 ♀ 92.88 ±21.52 50.88 ±18.19 1.31 ±0.44 0.8 ±0.16 2.6 ±0.49 10 ♂ 69 ±21.72 44.45 ±16.18 1.91 ±0.57 1.15 ±0.25 2.59 ±0.57 ZZ1 15 ♀ 67 ±21.54 42.6 ±23.02 2.19 ±0.47 0.82 ±0.21 2.61 ±0.55 11 ♂ 49.78 ±23.63 35.55 ±17.58 2.77 ±0.69 1.05 ±0.27 2.27 ±0.61 ZZ2 16 ♀ 92.75 ±30.64 42.31 ±20.74 2.67 ±0.73 0.91 ±0.34 2.21 ±0.97 12 ♂ 70.58 ±13.07 42.09 ±23.65 2.88 ±0.65 1.06 ±0.38 2.36 ±0.51

3 討論

在本研究中，對(duì)9 個(gè)野生小鼠來源對(duì)的1 號(hào)染色體替換系小鼠進(jìn)行了表型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在體長、體重、尾長，以及心臟、腎臟、腦部重量，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、總膽紅素、甘油三酯、總膽固醇這些指標(biāo)上都存在著替換系群體小鼠與B6 顯著差異。

縱觀替換系小鼠整體生長過程，特別是體重曲線上，大部分品系在不同時(shí)間段的生長速度存在2個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。1 ～19 d 時(shí)，生長速度較快，而19 ～31 d左右生長速度最快，31 d 以后，增長則較為平緩，并且品系之間的差異逐漸明顯，這一趨勢(shì)與先前結(jié)果基本一致［10］。

器官重量上總體差異不大，但在臟器系數(shù)上差異明顯。除心臟外的其他器官，替換系與B6 均存在顯著差異。體重、體長在內(nèi)的生長發(fā)育是由多個(gè)過程控制調(diào)節(jié)的，包括細(xì)胞增殖與生長，細(xì)胞的位置，細(xì)胞的凋亡［16］。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)身體發(fā)育和器官大小是由多個(gè)染色體影響的，因此仍有QTL 挖掘的空間。

不同的染色體替換系品系小鼠在血液生化指標(biāo)表現(xiàn)出較大的變異，如:TW 雌雄鼠在高密度脂蛋白、總膽固醇上的高數(shù)值;SMX 雌雄鼠在甘油三酯上顯示出的高數(shù)值。B6-A/J 的染色體替換系的研究中，在不同染色體上發(fā)現(xiàn)了7 個(gè)影響雄鼠血清膽固醇的QTL［8］，而在B6-M/m 的研究中則發(fā)現(xiàn)有14個(gè)染色體與膽固醇相關(guān)［10］。血液生化、解剖學(xué)的QTL 由基因和環(huán)境因素共同控制，但是自然環(huán)境累積的高度選擇壓力，使野生來源小鼠的表型在容易出現(xiàn)極端表型［17］。

基因背景的差異對(duì)于小鼠的生長發(fā)育、血液生化等表型都有非常大的作用。目前已有超過400 個(gè)控制重要生理生化性狀的QTL 在小鼠1 號(hào)染色體上被發(fā)現(xiàn)［10，13，18，19］。這些QTL 可以認(rèn)為是前人完成的科研“半成品”，需進(jìn)一步的精細(xì)定位以便克隆相關(guān)基因。野生來源小鼠的許多指標(biāo)已經(jīng)展現(xiàn)出與基因功能研究的相關(guān)性［20，21］，是系統(tǒng)研究復(fù)雜性狀新通路和新調(diào)控方式的潛在資源［3，22］。隨著DNA測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，高通量的基因組測(cè)序數(shù)據(jù)已經(jīng)遠(yuǎn)快于生理生化數(shù)據(jù)的產(chǎn)出，然而表型數(shù)據(jù)仍是揭示基因功能的重要基礎(chǔ)［23］。

［1］O’Brien T，Woychik R.Our small relative ［J］.Nat Genet，2003，33:3 －4.

［2］Laurie CC，Nickerson DA，Anderson AD，et al.Linkage disequilibrium in wild mice［J］.PLoS Genet，2007，3(8):e144.

［3］Guenet JL，Bonhomme F.Wild mice:An ever-increasing contribution to a popular mammalian model［J］.Trends Genet，2003，19(1):24 －31.

［4］Wade CM，Kulbokas EJ，Kirby AW，et al.The mosaic structure of variation in the laboratory mouse genome［J］.Nature，2002，420:574 －578.

［5］Nadeau JH，Singer JB，Matin A，et al.Analysing complex genetic traits with chromosome substitution strains［J］.Nat Genet，2000，24(3):221 －225.

［6］Matin A，Collin GB，Asada Y，et al.Susceptibility to testicular germ-cell tumours in a 129.MOLF-Chr 19 chromosome substitution strain［J］.Nat Genet，1999，23:237 －240.

［7］Cowley AW Jr，Roman RJ，Kaldunsk ML，et al.Brown Norway chromosome 13 confers protection from high salt to consomic Dahl S rat［J］.Hypertension，2001，37(2):456 －461.

［8］Singer JB，Hill AE，Burrage LC，et al.Genetic dissection of complex traits with chromosome substitution strains of mice［J］.Science，2004，304(5669):445 －448.

［9］Shao H，Burrage LC，Sinasac DS，et al.Genetics architecture of complex traits:large phenotypic effects and pervasive epistasis［J］.Proc Natl Acad Sci，2008，105(50):19910 －19914.

［10］Takada T，Mita A，Maeno A，et al.Mouse inter-subspecific consomic strains for genetic dissection of quantitative complex traits［J］.Genome Res，2008，18(3):500 －508.

［11］Gregorova S，Divina P，Storchova R，et al.Mouse consomic strains:exploiting genetic divergence between Mus m.musculus and Mus m.domesticus subspecies［J］.Genome Res，2008，18(3):509 －515.

［12］Singer JB，Hill AE，Nadeau JH，et al.Mapping quantitative trait loci for anxiety in chromosome substitution strains of mice［J］.Genetics，2005，169(2):855 －862.

［13］Xiao J，Liang Y，Li K，et al.A novel strategy for genetic dissection of complex traits:the population of specific chromosome substitution strains from laboratory and wild mice［J］.Mamm Genome，2010，21(7 －8):370 －376.

［14］Salcedo T，Geraldes A，Nachman MW.Nucleotide variation in wild and inbred mice［J］.Genetics，2007，177(4):2277 －2291.

［15］Mott R，F(xiàn)lint J.Prospects for complex trait analysis in the mouse［J］.Mamm Genome，2008，19(5):306 －308.

［16］Conlon I，Raff M.Size control in animal development［J］.Cell，1999，96(2):235 －244.

［17］Zhou Y，Liang Y，Li K，et al，The phenotypic distribution of quantitative traits in a wild mouse F1 population［J］.Mamm Genome，2012，23(3 －4):232 －240.

［18］Champy MF，Selloum M，Zeitler V，et al，Genetic background determines metabolic phenotypes in the mouse［J］.Mamm Genome，2008，19(5):318 －331.

［19］http:www.informatics.jax.org

［20］管彤，張靜姝，李大鳴，et al.TW 近交系小鼠的血液生化及毛色基因檢測(cè)［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(4):39 －42

［21］張婷婷，仝莉，肖君華，等.特異區(qū)段替換小鼠性發(fā)育表型的研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2013，21(2):1 －7

［22］Peters LL，Robledo RF，Bult CJ，et al.The mouse as a model for human biology:a resource guide for complex trait analysis［J］.Nat Rev Genet，2007，8:58 －69

［23］Brown SD，Hancock JM，Gates H.Understanding mammalian genetic systems:the challenge of phenotyping in the mouse［J］.PLoS Genet，2006，2(8):1131 －1137.