白花蛇舌草總黃酮對BGC-823胃癌細胞增殖和凋亡的影響

王秋蘭，高曉民，張 煦

(1. 甘肅中醫藥大學臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000；2. 蘭州大學病理研究所，甘肅 蘭州 730000)

白花蛇舌草總黃酮對BGC-823胃癌細胞增殖和凋亡的影響

王秋蘭1，高曉民2，張 煦2

(1. 甘肅中醫藥大學臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000；2. 蘭州大學病理研究所，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討白花蛇舌草總黃酮對BGC-823胃癌細胞增殖和凋亡的影響。方法 采用MTT法檢測3.125，6.25，9.375，12.5，25.0及50.0 μg/mL白花蛇舌草總黃酮作用24 h及48 h對BGC-823胃癌細胞的抑制率，流式細胞儀檢測白花蛇舌草總黃酮對細胞周期及細胞凋亡的影響。結果 作用24 h，白花蛇舌草總黃酮3.125,6.25 μg/mL對BGC-823胃癌細胞無明顯抑制作用，9.375，12.5，25，50 μg/mL有明顯抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高為51.5%,同期1μg/mL順鉑組為82.4%；作用48 h，白花蛇舌草總黃酮3.125,50 μg/mL對BGC-823胃癌細胞無明顯抑制作用，6.25,9.375,12.5,25 μg/mL對BGC-823胃癌細胞均有明顯抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高為67.3%,同期1μg/mL順鉑組為85.4%。實驗各組48 h抑制率均高于24 h。經白花蛇舌草總黃酮梯度藥物處理的BGC-823胃癌細胞懸浮死亡，且隨藥物濃度的增加懸浮死亡的細胞增多，細胞呈現凋亡特征。白花蛇舌草總黃酮試驗組與對照組比較，G1期細胞增加,S期細胞明顯減少，凋亡細胞比例明顯增高。結論 白花蛇舌草總黃酮對BGC-823胃癌細胞的生長增殖有明顯抑制作用，并表現出一定范圍內的時-效及量-效關系，作用機制可能與抑制DNA的合成、誘導細胞凋亡有關。

白花蛇舌草；總黃酮；BGC-823胃癌細胞；增殖；凋亡

白花蛇舌草(HedyotisdiffusaWild)系茜草科耳草屬植物, 為帶根全草，別名蛇舌草，具有清熱解毒、利濕、消腫鎮痛、抗癌，增強免疫之功效[1]。白花蛇舌草總黃酮是從白花蛇舌草中提取的有效成分，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤的作用[2-4]。目前該成分的提取工藝已取得較大發展，相關研究眾多[5-6]，而其臨床應用有待拓展。筆者觀察了白花蛇舌草總黃酮體外對人BGC-823胃癌細胞增殖和凋亡的影響，現將結果報道如下。

1 實驗資料

1.1材料 白花蛇舌草購于蘭州安寧醫藥公司，經甘肅中醫學院中藥鑒定教研室林麗老師鑒定為茜草科耳草屬白花蛇舌草干燥全草。乙醇回流法提取白花蛇舌草總黃酮，AB-8型號大孔吸附樹脂(滄州寶思吸附材料科技有限公司)進行純化，總黃酮純度約為23.82%，用DMEM配置成100 μg/mL的溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝，4 ℃保存。蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：201207)，順鉑(齊魯制藥有限公司)，BCG-823胃癌細胞株(甘肅中醫藥大學李海龍老師惠贈)，MTT、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma 公司),DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國HyClone公司)。Annexin V-FITC /PI凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司)，碘化丙啶(Sigma公司)。酶標儀(ELX-800，美國BIO-TEK公司)；流式細胞儀(美國 Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖的檢測 MTT法檢測BGC-823胃癌細胞增殖情況。收集對數生長期的BGC-823胃癌細胞，胰酶消化制成細胞懸液，計數后按1.0×107L-1細胞濃度100 μL加入96孔平底板，5%CO2，37 ℃下孵育，倒置顯微鏡下觀察，細胞貼壁后，加入白花蛇舌草總黃酮梯度藥物，使其中濃度分別為3.125,6.25,12.5,25.0,50.0 μg/mL，每孔100 μL,設5個復孔，同時設置培養基、藥物調零孔、同體積PBS對照孔及1 μg/mL順鉑對照孔。24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，繼續培養4 h。吸去孔內培養液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上于波長570 nm處測量各孔的吸光值。按下列公式計算增殖抑制率:增殖抑制率(%)=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100 %。根據抑制率篩選藥物濃度。

1.2.2 細胞形態觀察 收集對數生長期的BGC-823胃癌細胞，以完全培養基調節細胞濃度為2.0×108L-1接種于培養瓶中，分為對照組和實驗組，實驗組在細胞貼璧培養24 h后加入梯度白花蛇舌草總黃酮，繼續培養48 h，倒置顯微鏡下觀察BGC-823胃癌細胞形態并攝片。

1.2.3 細胞周期的檢測 將呈對數生長期，細胞密度為70%的BGC-823胃癌細胞分為3組，加入PBS為陰性對照組，1 μg/mL順鉑為陽性對照組，用最佳抑菌濃度白花蛇舌草總黃酮作用為實驗組，細胞數約1.0×106個，24 h后PBS洗滌，4 ℃條件下70%乙醇固定，過夜，PI染色，400目尼龍網過濾后，流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.2.4 細胞凋亡的檢測 實驗分2組，PBS為對照組，用9.375 μg/mL白花蛇舌草總黃酮作用24 h為實驗組。采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒嚴格按說明書進行細胞凋亡檢測。

2 結 果

2.1各組BGC-823胃癌細胞增殖情況 作用24 h，3.125，6.25 μg/mL白花蛇舌草總黃酮對BGC-823胃癌細胞無明顯抑制作用，9.375，12.5，25，50 μg/mL對BGC-823胃癌細胞有明顯抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高；順鉑組抑制率更高。作用48 h， 3.125，50 μg/mL白花蛇舌草總黃酮對BGC-823胃癌細胞抑制率較低，6.25,9.375,12.5,25 μg/mL對BGC-823胃癌細胞均有明顯抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高；順鉑組抑制率更高。實驗各組48 h抑制率均高于24 h；12.5 μg/mL與9.375 μg/mL抑制率比較差異均無統計學意義。9.375 μg/mL為最佳抑菌濃度。見表1。

表1 各組BGC-823胃癌細胞增殖情況

注：①與對照組比較。

2.2 各組BGC-823胃癌細胞形態比較 光學顯微鏡下觀察，未經白花蛇舌草總黃酮處理的BGC-823胃癌細胞貼壁生長良好，多邊形且排列密集，細胞生長活躍，細胞邊緣清晰，見圖1。經白花蛇舌草總黃酮梯度藥物處理的BGC-823胃癌細胞懸浮死亡，且隨藥物濃度的增加，懸浮死亡的細胞亦增多；細胞膜皺縮，排列稀疏，體積變小，細胞變形呈圓形或橢圓形，部分細胞呈現凋亡特征，見圖2。

2.3 各組BGC-823胃癌細胞周期比較 與陰性對照組比較，實驗組G1期細胞比例增加,S期細胞明顯減少；與順鉑組比較，實驗組G1期細胞比例相似，G2期細胞明顯減少。見圖3～5。

圖1 對照組BGC-823胃癌細胞形態

圖2 實驗組9.375 μg/mL白花蛇舌草總黃酮干預48 h BGC-823胃癌細胞形態

圖3 陰性對照組細胞周期

2.4 各組BGC-823胃癌細胞凋亡情況 實驗組凋亡細胞比例明顯高于對照組，活細胞比例明顯低于對照組。見圖6及圖7。

3 討 論

白花蛇舌草總黃酮抗腫瘤作用明顯。王宇翔等[10]研究認為,白花蛇舌草總黃酮可明顯促進Cy降低小鼠LpS和ConA誘導的脾細胞增殖反應,提高T淋巴細胞及B淋巴細胞轉化能力,該總黃酮60 mg/kg可明顯促進Cy降低小鼠脾臟IgM抗體形成,有增強機體細胞免疫和體液免疫作用,且對腫瘤化療藥物有一定的解毒作用。周憶新等[3]研究發現白花蛇舌草總黃酮對肝癌細胞株HepG-2形態有明顯影響,并可抑制其生長并誘導其凋亡。吳楊等[11]用乙醇回流法提取白花蛇舌草總黃酮并發現其對肝癌細胞HepG-2有明顯抑制作用，并且隨著濃度的增大,抑制率越高；隨著培養時間的延長,抑制率也增高。楊嫻等[12]報道白花蛇舌草總黃酮能有效抑制黑色素瘤A375和B16細胞增殖,且具有一定的時-效和量-效關系。楊培民等[13]研究發現白花蛇舌草脂質體中的多糖和黃酮成分配伍應用,共奏“扶正祛邪”之效,符合傳統中醫復方“多成分、多靶點、多途徑”的作用特點,從而發揮“整體效應”。張碩等[14]利用基因芯片技術研究了白花蛇舌草總黃酮抑制人肝癌細胞SMMC-7721的靶基因及其調控，結果篩選出20個總黃酮抑制肝癌細胞的有效基因，其中癌基因pim-1、rel、ras、fos、myc、met及Bcl-2顯著下調,抑癌基因NF2顯著上調,成纖維細胞生長因子、G蛋白耦聯受體、酪氨酸蛋白磷酸化酶、轉錄因子12等信號轉導分子顯著下調，而絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導通路成員MAP2K6和MAP3K12、T細胞活化共刺激信號分子TNFSF9、TNFSF7基因顯著上調。研究表明總黃酮抑制人肝癌細胞SMMC-7721由多個基因協調，并通過胞內、胞外信號轉導途徑共同完成。進一步研究表明，白花蛇舌草總黃酮在體內、體外具有抑制肝癌細胞的作用，這種作用與阻滯腫瘤細胞增殖周期，促進腫瘤細胞凋亡，提高脾淋巴細胞轉化率、血清TNF-α水平，改善機體免疫環境等有關[15]。顧玉蘭等[16]研究結果顯示白花蛇舌草乙醇提取物能夠顯著抑制胃癌細胞BGC-823端粒酶的活性，并呈劑量依賴性[17]。

圖4 實驗組細胞周期

圖5 陽性對照組細胞周期

圖6 對照組BGC-823胃癌細胞凋亡情況

圖7 實驗組BGC-823胃癌細胞凋亡情況

本研究結果顯示，9.375，12.5，25，50 μg/mL白花蛇舌草總黃酮作用24 h對BGC-823胃癌細胞均有明顯抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高；6.25，9.375，12.5，25 μg/mL白花蛇舌草總黃酮作用48 h對BGC-823胃癌細胞均有明顯抑制作用，其中12.5 μg/mL抑制率最高。實驗各組48 h抑制率均高于24 h。12.5 μg/mL與9.375 μg/mL抑制率比較差異無統計學意義，故選擇藥物濃度9.375 μg/mL用于細胞周期和凋亡的檢測。白花蛇舌草總黃酮對BGC-823胃癌細胞抑制作用表現出一定范圍內的時間-效應及劑量-效應關系，其機制有可能是多個基因協調,包括癌基因如ras、fos、myc、met 及Bcl-2抑制,抑癌基因如NF2的激活,并通過胞內、胞外信號轉導途徑共同完成，如MAPK及TPK等。

本實驗中，經白花蛇舌草總黃酮梯度藥物處理的BGC-823細胞懸浮死亡，且隨藥物濃度的增加，懸浮死亡的細胞亦增多；細胞變形，部分細胞呈現凋亡特征；凋亡細胞比例明顯高于對照組，活細胞比例明顯低于對照組，這種作用與阻滯腫瘤細胞增殖周期、促進腫瘤細胞凋亡密切相關。另外白花蛇舌草總黃酮組G1期細胞增加,S期細胞明顯減少，提示白花蛇舌草總黃酮對DNA復制有一定的抑制作用，可能通過抑制端粒酶的活性起作用，其機制有待于進一步深入研究。

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Effect of the total flavones of oldenlandia diffusa on the proliferation and apoptosis of gastric cancer cell BGC-823

WANG Qiulan1, GAO Xiaomin2, ZHANG Xu2

(1.Clinical Medical College of Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, Gansu, China; 2. Pathology Institute of Lanzhou University, Lanzhou 730000, Gansu, China)

Objective It is to approach the influence of the total flavones of oldenlandia diffusa (TFOD) on the proliferation and apoptosis of gastric cancer cell BGC-823. Methods The inhibition of TFOD in dose of 3.125, 6.25, 9.375, 12.5, 25.0 and 50.0 μg/mL on BGC-823 cells for 24 and 48 hours were measured by MTT assay; the influence of TFOD on the proliferation cycle and apoptosis of BGC-823 was detected by Flow Cytometry. Results After 24 hours, the dose of TFOD in 3.125 and 6.25 μg/mL had no obvious inhibition, but in 9.375, 12.5, 25.0 and 50.0 μg/mL had obvious inhibitory effect, the highest inhibition rate was 51.5% that appeared in 12.5 μg/mL group, positive control group 1μg/mL cisplatin was 82.4%; after 48 hours, the dose of TFOD in 3.125 and 50.0 μg/mL had no obvious inhibition, but in 9.375, 12.5 and 25.0 μg/mL had obvious inhibitory effect, the highest inhibition rate was 67.3% that appeared in 12.5 μg/mL group, too, positive control group 1 μg/mL cisplatin was 85.4%; inhibition rate of 48 hours were higher than that of 24 hours in experimental group; BGC- 823 cells treated by TFOD in gradient, cell died, and with the increase of drug concentration, the increase in the number of cells death; cell membrane shrinked, arranged sparsely, volume contracted, cell deformed into circular or elliptic, presented apoptosis features; compared to control group, cells in G1phase of TFOD increased, and cells in S phase decreased significantly; the apoptosis cell ratio is significantly higher than that of the control group. Conclusion TFOD has inhibitory effect on gastric cancer cells BGC- 823 in vitro and shows time-effect and dose-effect relationship in a certain range; the mechanism may be related to inhibition of TFOD in DNA synthesis and inducing cell apoptosis.

oldenlandia diffusa; total flavones; gastric cancer cells BGC-823; proliferation; apoptosis

王秋蘭，女，碩士，副教授,主治醫師，從事腫瘤學研究。

甘肅省高等學校基本科研業務費項目(2012-5)；甘肅省自然科學基金項目(145RJZA235)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.21.004

R-33

A

1008-8849(2015)21-2289-04

2015-03-15