大腸癌局部微環境中細胞免疫功能狀況與預后的關系

馮國光，陳 峰，丁新德，朱松明，高 銘，顧志相

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院，上海 202150)

大腸癌局部微環境中細胞免疫功能狀況與預后的關系

馮國光，陳 峰，丁新德，朱松明，高 銘，顧志相

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院，上海 202150)

目的 探討大腸癌根治術后患者細胞免疫功能狀況與預后的關系。方法 取146例大腸癌患者手術切除標本石蠟塊。采用免疫組織化學染色技術檢測腫瘤、瘤旁1 cm和瘤旁8～10 cm腸壁組織(正常腸壁組織)中CD3+、CD4+、CD8+、B細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、樹突狀細胞(DC細胞)和轉錄因子叉頭框蛋白P3+調節性T細胞(Foxp3+Tregs)水平，采用Kaplan-Meier和Cox回歸分析評估這些指標對預后的影響。結果 腫瘤組織中CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞、DC細胞和Foxp3+Tregs表達量顯著高于瘤旁1 cm組織及正常腸壁組織(P均<0.05)； 腫瘤組織中CD8+、NK細胞和DC細胞高表達組T3、T4期和區域淋巴結轉移例數均顯著低于低表達組(P均<0.05)；腫瘤組織中Foxp3+Tregs高表達組高TNM分期、術后腫瘤復發轉移和死亡例數均顯著高于低表達組(P均<0.05)；腫瘤組織內Foxp3+Tregs高表達與TNM高分期和差的預后有顯著關系(P均<0.05)，并且是術后的一個獨立預后因素。結論 腫瘤組織中Foxp3+Tregs表達量與大腸癌根治術后患者預后密切相關，腫瘤組織中Foxp3+Tregs高表達是大腸癌根治術患者預后的一個獨立危險因素。

大腸癌；細胞免疫；Foxp3+Tregs；預后

正常情況下，在腫瘤形成前機體免疫系統可通過細胞免疫特異性殺滅引發腫瘤的突變細胞，而免疫系統缺陷、宿主對腫瘤抗原缺乏反應是惡性腫瘤發生和發展的重要因素。大腸癌是臨床常見腫瘤，多采取根治術治療，但根治術后復發和轉移是造成患者死亡的重要原因。惡性腫瘤局部免疫微環境與預后有著密切的關系，其中腫瘤浸潤調節性T細胞(tumor-infiltrating regulatory T cells，Tregs)可能起著重要作用。本研究探討了大腸癌局部免疫微環境與預后的關系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2007年1月—2008年12月在上海新華醫院崇明分院經病理證實的146例首次大腸癌根治手術患者標本，其中男79例，女67例；年齡42～81歲，平均65歲。患者資料完整，無自身免疫性疾病史，無化療、放療、生物及免疫治療史。所有手術基本由同一個手術團隊完成，保證手術質量的一致性。腫瘤部位：結腸94例(盲腸12例，升結腸及肝曲18例，橫結腸例9例，降結腸及脾曲13例，乙結腸42例)，直腸52例。腫瘤直徑1.5～12 cm，平均2.7 cm。手術方式：右半結腸切除30例，橫結腸切除9例，左半結腸切除13例，乙狀結腸切除42例，直腸經腹切除47例，經腹會陰聯合切除5例。組織病理學分類、腫瘤浸潤深度、區域淋巴結轉移情況、TNM分期見表1。生存期從手術日計算，終止日期為死亡日或末次隨訪日，所有病例隨訪截止日期為2013年12月31日。隨訪結果：局部復發8例(5.5%)，遠處轉移28例(19.2%)，與術后腫瘤復發轉移相關的死亡36例，總的5年生存率為75.3%(110/146)。

1.2 研究方法 分別用不同的單克隆抗體對CD3+、CD4+、CD8+、B細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、樹突狀細胞(DC細胞)和轉錄因子叉頭框蛋白P3+Tregs(Foxp3+Tregs)進行免疫組化染色，采用免疫組織化學染色技術檢測各種免疫細胞在大腸癌患者腫瘤、瘤旁1 cm和瘤旁8～10 cm腸壁組織(正常腸壁組織)中的表達量，分析各種免疫細胞間的關系及與患者臨床病理和預后的關系。免疫細胞參數變量按中位數分為高表達組和低表達組。鼠抗人CD3(MAB-0030，克隆號：PS1)、鼠抗人CD4(MAB-0251，克隆號：4B12)、兔抗人CD8(RMA-0514，克隆號：SP16)、B細胞鼠抗人CD20 (MAB-0020，克隆號：L26)、NK細胞鼠抗人CD57(MAB-0257，克隆號：NK1)、DC細胞兔抗人S-100(RAB-0150) 來自Maixin-Bio(邁新生物)。Foxp3+Treg抗體：affinity purified anti human Foxp3(目錄號：85-14-4776-80，克隆號：PCH101)來自eBioscience公司(Foxp3是人Treg特異性抗體)，二抗均來自Leica的標準試劑——Leica二抗套裝試劑，包括抗原修復液、脫蠟溶液、洗滌溶液等。采用Leica公司的全自動免疫組化染色一體機，免疫組化的所有步驟包括烤片、脫蠟、抗原修復、阻斷、標記一炕、標記二抗、顯色直到復染都由Bond-Max自動完成。

表1 146例大腸癌病理組織學分類、腫瘤浸潤深度、區域淋巴結轉移及TNM分期 例

1.3 免疫細胞計數 在400倍顯微鏡下觀察陽性細胞，判定標準為細胞膜或細胞核呈紅色或棕色顆粒。利用電腦圖像采集系統，隨機選取5個高倍視野拍照，再用圖像分析軟件(NIH Image 1.46 bundled with 64-bit Java)計算陽性細胞數。由2位高年資病理科醫生雙盲交叉讀片，取平均值。

1.4 統計學方法 采用SPSS 12.0統計軟件包進行數據處理，用t檢驗或四格表2檢驗進行組間數據比較；用Kaplan-Meier做各免疫參數變量與預后的關系分析；用Cox回歸模型做單因素和多因素與預后關系分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各種免疫細胞在大腸癌局部微環境中的分布 大腸癌腫瘤組織中CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞、DC細胞和Foxp3+Tregs表達量顯著高于瘤旁1 cm組織及正常大腸壁組織(P均<0.05)，而瘤旁1 cm組織與正常大腸壁組織間表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。腫瘤組織中B細胞表達量與瘤旁1 cm組織及正常大腸壁組織表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 大腸癌局部微環境各組織中免疫細胞檢測結果

注：①與腫瘤組織比較，P<0.05。

2.2 大腸癌腫瘤組織中CD8+、NK細胞和DC細胞與臨床病理特點的關系 大腸癌腫瘤組織中CD8+、NK細胞和DC細胞高表達組的T3、T4期和區域淋巴結轉移例數均顯著低于低表達組(P均<0.05)，但與患者術后生存情況無直接相關性。見表3。

2.3 大腸癌局部微環境各組織中Foxp3+Tregs細胞與臨床病理特點的關系 腫瘤組織中Foxp3+Tregs高表達組TNM分期、術后腫瘤復發轉移和死亡例數均顯著高于低表達組(P均<0.05)；腫瘤旁1 cm 和正常腸壁組織中Foxp3+Tregs表達與患者臨床病理特點無相關性，見表4。

2.4 大腸癌腫瘤組織中Foxp3+Tregs表達與預后的關系對患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期以及腫瘤局部各免疫參數做Cox單因素生存分析，結果顯示腫瘤組織中Foxp3+Tregs高表達與TNM高分期和差預后顯著相關(P均<0.05)，癌旁1 cm和正常腸壁組織內各種免疫細胞表達量與大腸癌預后無顯著相關性，見表5。多因素分析亦顯示腫瘤組織中Foxp3+Tregs表達差異和TNM分期高低是大腸癌患者根治術后獨立預后因素，見表6。

表3 大腸癌腫瘤組織中CD8+、NK細胞和DC細胞與臨床病理特點的關系 例

注：①與低表達組比較，P<0.05。

表4 大腸癌局部微環境各組織中Foxp3+Tregs細胞與臨床病理特點的關系 例

注：①與腫瘤組織組中低表達組比較，P<0.05。

3 討 論

惡性腫瘤的發生、發展和術后局部復發、遠處轉移與機體免疫功能低下、腫瘤細胞逃逸了機體的免疫監控有重要關系。而眾多免疫細胞在腫瘤局部聚集反映了全身免疫系統對局部腫瘤的免疫應答。浸潤在腫瘤周圍的淋巴細胞不僅有效應性CD8+T細胞或CD4+T細胞，而且還有大量的Tregs，主要是CD4+、CD25+T細胞。通常認為腫瘤組織內Tregs異常增高有以下3種機制：①腫瘤相關抗原(TAAs)的刺激引起Tregs的活化、增殖；②腫瘤細胞分泌的趨化因子誘導Tregs聚集到腫瘤局部；③一些細胞因子的分泌和誘導。因此Tregs在腫瘤局部集聚是其發揮免疫抑制作用的基礎，而隨著抑制功能的發揮又進一步促進了Tregs的聚集。

本研究結果顯示，大腸癌腫瘤組織中CD8+、NK細胞和DC細胞表達量與腫瘤浸潤深度和區域淋巴結轉移呈負相關，但是與患者預后無顯著相關性，提示它們具有降低腫瘤浸潤深度及減少淋巴結轉移作用。其機制在于：首先惡性腫瘤轉移的潛在能力在于克隆大量異常蛋白，這些異常蛋白有助于轉移，但這些異常蛋白作為腫瘤相關抗原容易被免疫微環境內原位免疫反應破壞；其次高密度的腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes，TILs)通常意味著一個健康的免疫系統。在淋巴結內發生的免疫反應也可能發揮應有的功能，對抗腫瘤細胞并將其排入淋巴結內，而淋巴結內轉移灶的腫瘤負荷小于原發灶。因此，轉移灶更容易受到免疫反應完全破壞[1]。既往的研究認為，腫瘤局部TILs高浸潤預示著良好的預后[2-3]，但近年來隨著對TILs深入研究，尤其是發現大量具有免疫抑制和調節功能的Treg后，人們對TILs在腫瘤微環境的作用有了新的認識。

表5 Cox單因素生存分析

表6 Cox多因素生存分析

Kim等[4]認為，大腸癌腫瘤組織中Foxp3的表達與患者疾病的進展相關，而不是Tregs；但是大腸癌Foxp3表達與臨床相關性還沒有獲得詳細的評估。以往對一些實體腫瘤包括胰腺癌、肝癌的研究發現，高密度Foxp3+Tregs浸潤患者預后差[5-6]。本研究顯示，大腸癌腫瘤組織中Foxp3+Tregs表達量較正常腸壁組織顯著增多，它反映了在腫瘤位點，宿主與腫瘤之間的免疫狀況改變，而Foxp3+Tregs高表達者TNM分期較晚，預后也明顯差于低表達者，與文獻[7-11]報道的結果相同。

Xu等[10]對90例結腸腺癌的研究結果提示，Foxp3陽性癌細胞的出現與更差的預后相關，認為癌巢中出現Tregs是結腸癌總生存率的一個獨立危險因素，而Foxp3陽性癌細胞也可能是影響預后的一個危險因素。但是也有研究認為Foxp3+Tregs的絕對數量和大腸癌患者預后之間無顯著相關性[5]。甚至有研究認為，高頻率的Foxp3+Tregs事實上可能與一個良好的而不是糟糕的預后相關[12]。本研究發現，腫瘤組織中Foxp3+Tregs表達量是大腸癌患者根治術后的一個獨立預后因素，與Grimmig等[11]觀點相同。通常有效的抗腫瘤免疫反應能抑制腫瘤細胞的潛在侵襲性，具有免疫抑制功能的Foxp3+Tregs則可能放任腫瘤侵襲轉移，這或許就是腫瘤內Foxp3+Tregs高表達者根治術后易發生復發轉移和預后差的原因。筆者認為Foxp3+Tregs主導了不良的免疫環境，在腫瘤進展時抵消了抗腫瘤的免疫反應。此外，腫瘤細胞本身的Foxp3 表達也可能使它們逃避效應T細胞的反應，導致腫瘤生長發展[4]，因而對患者預后造成不良影響。Foxp3+Tregs作用機制主要是通過抑制效應T細胞的增殖和活化，導致免疫抑制細胞因子如IL-10和TGF-β分泌到腫瘤微環境[11]，抑制CD8+T細胞和NK細胞對腫瘤的殺傷作用[13]，引起DC細胞的凋亡[14]等途徑影響效應T細胞對腫瘤的免疫應答。

本研究結果提示，大腸癌組織內Foxp3+Tregs的表達狀況是大腸癌患者的獨立預后因素，為臨床提供了一條極具價值的思路：①術后腫瘤組織免疫組化檢測Foxp3+Tregs可輔助判斷大腸癌根治術后患者的預后。②通過利用和激發機體的免疫反應來對抗、抑制和殺滅腫瘤細胞(即大腸癌的免疫治療)以改善患者的預后。目前對于腫瘤的免疫治療探索動物實驗居多，臨床研究正在加速開展。近年來在美國，樹突狀細胞治療性疫苗在惡性淋巴瘤、前列腺癌、胃癌等多個腫瘤的治療研究已進入最后的臨床試驗。在我國，大腸癌樹突狀細胞治療性疫苗已進入二期臨床研究。但是如何精確調控患者機體的免疫功能達到最大限度的治療效果，而又不會增加患者自身免疫性疾病的風險，需要對Treg這類T淋巴細胞亞群的結構、功能、調控機制做進一步深入研究。

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The relationship between the status of cellular immune function in local microenvironment and prognosis in patients with colorectal cancer

FENG Guoguang, CHEN Feng, DING Xinde, ZHU Songming, GAO Ming, GU Zhixiang

(Chongming Branch of Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 202150, China)

Objective It is to approach the relationship between the status of cellular immune function in local microenvironment and prognosis in patients with colorectal cancer. Methods Paraffin blocks of operation resection of colorectal cancer were obtained from 146 patients. The levels of CD3+, CD4+, CD8+, B cells, natural kill cells (NK), dendritic cells (DC) and the transcription factor forkhead box protein P3+ regulatory T cells (Foxp3+Tregs) in the tissues of tumor and the intestine wall adjacent to tumor tissues of 1 cm and 8 to 10 cm were detected by immunohistochemistry staining technique to evaluate the relationship on prognostic effects by Kaplan-Meier and Cox regression analysis. Results The intratumoral CD3+, CD4+, CD8+, NK cells, DC cells and Foxp3+ Tregs counts were significantly higher than those in peritumoral 1 cm tissue and normal intestinal tissue (allP<0.05); The cases of T3, T4stage and regional lymph node metastasis in the intratumoral CD8+, NK and DC cells high counts group were significantly lower than those in the intratumoral CD8+, NK and DC cells low counts group (allP<0.05); the cases of T3, T4stage, recurrence and metastasis of tumor and deaths after operation in the intratumoral Foxp3+ Tregs high counts group were significantly higher than those in the intratumoral Foxp3+ Tregs low counts group (all P<0.05); the increased intratumoral Foxp3+ Tregs counts were associated with higher TNM stage and worse prognosis and was an independent prognostic factor for overall survival (allP< 0.05). Conclusion The intratumoral Foxp3+ Tregs counts are closely associated with the prognosis in patients with colorectal cancer after radical resection. The higher intratumoral Foxp3+ Tregs counts is an independent prognostic risk factor in patients with colorectal cancer after radical resection.

colorectal cancer; cellular immunity; Foxp3+ Tregs; prognosis

馮國光，男，主任醫師，研究方向為大腸癌的防治。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.21.007

R0735.34

A

1008-8849(2015)21-2299-04

2015-02-28