甘肅省中部沿黃灌區輪作和連作馬鈴薯根際土壤真菌群落的結構性差異評估

劉 星, 邱慧珍,*, 王 蒂, 張俊蓮, 沈其榮

1 甘肅農業大學資源與環境學院，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室, 蘭州 730070 2 甘肅農業大學農學院, 蘭州 730070 3 南京農業大學資源與環境科學學院, 南京 210095

甘肅省中部沿黃灌區輪作和連作馬鈴薯根際土壤真菌群落的結構性差異評估

劉 星1, 邱慧珍1,*, 王 蒂2, 張俊蓮2, 沈其榮3

1 甘肅農業大學資源與環境學院，甘肅省干旱生境作物學重點實驗室, 蘭州 730070 2 甘肅農業大學農學院, 蘭州 730070 3 南京農業大學資源與環境科學學院, 南京 210095

甘肅省中部沿黃灌區是西北地區乃至全國重要的加工型馬鈴薯生產基地, 然而因集約化種植帶來的連作障礙問題已經嚴重影響到當地馬鈴薯種植業的可持續發展。采用大田試驗與PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技術相結合的方法, 并通過真菌的18S rDNA序列分析, 評估輪作(未連作)和連作條件下馬鈴薯根際土壤真菌群落在組成結構上的差異, 以期為甘肅省中部沿黃灌區馬鈴薯連作的土壤障礙機理研究提供新證據。結果表明, 同輪作相比, 連作顯著降低了馬鈴薯塊莖產量和植株生物量, 并且隨著連作年限的延長, 連作障礙也愈加嚴重。長期連作(6a)也導致馬鈴薯根冠比顯著增加和植株收獲指數的顯著下降。在根際土壤真菌的種群數量和多樣性上, 連作和輪作間無顯著差異, 但在群落組成結構上差異明顯。真菌18S rDNA測序分析進一步表明, 馬鈴薯連作較輪作相比增加了Fusariumsp.和Fusariumsolani以及Verticilliumdahliae的種群或個體數量，而這些真菌是導致馬鈴薯土傳病害的主要致病菌類型。根際土壤真菌群落組成結構的改變特別是與土傳病害有關的致病菌滋生可能是導致當地馬鈴薯連作障礙的重要原因。

馬鈴薯; 輪作和連作; 真菌群落結構; 微生物多樣性

Evaluation on fungal community structure of rhizosphere soils of potato under

rotation and continuous cropping systems in Yellow River Irrigation Areas of

甘肅省中部沿黃灌區是西北地區乃至全國重要的加工型馬鈴薯生產基地, 當地馬鈴薯種植主要呈現規模化、機械化和集約化的特點, 經營銷售模式通常以訂單農業為主。隨著近年來農產品價格的不斷走高和馬鈴薯消費逐步向高附加值產品轉變, 當地農墾企業在滿足旺盛的訂單需求的同時也造成種植結構相對單一、倒茬困難和馬鈴薯的多年連作[1]。這導致了植株生長發育受阻, 塊莖產量和品質下降, 特別是土傳病害猖獗等一系列的問題, 嚴重影響企業的種植效益。因而探明馬鈴薯種植的連作障礙機理, 進而尋求緩解和克服馬鈴薯連作障礙的有效途徑對于促進該地區馬鈴薯生產的可持續發展具有重要的理論意義和實踐價值。良好的土壤環境是作物高產穩產的基礎, 有關于連作土壤障礙因素的研究也已成為全球性熱點[2]。連作系統下土壤的生物相特別是微生物群落結構的變化受到眾多研究者的關注。微生物是土壤生態系統的重要組成部分, 其在結構和功能上具有高度的多樣性, 因而在能量傳遞, 養分循環, 礦質化和腐殖化, 以及污染物的降解等土壤一系列重要的生化過程中起著重要作用[3- 4]。早前的報道已經證明[5- 7], 微生物群落結構是表征健康高產土壤的重要因子, 同時也對于土傳病害的抑制具有重要的作用。結合現代分子生物學的技術手段, 在甘蔗[8]、大豆[9]和黃瓜[10]上的研究已證明, 連作顯著影響根際土壤的微生物群落結構, 這可能是導致連作障礙產生的重要原因, 但在具體的微生物種類對連作的響應特征上存在著不一致的結果, 可能是受作物品種和供試條件的差異所致。Lang等[11]在棉花上的研究證明連作條件下微生物群落結構變化與土傳病害發生存在直接關系, Larkin等[12]在連作馬鈴薯的研究中也得到了相似的結論。然而, 連作系統下土壤微生物群落行為特征受作物品種、施肥、土壤、氣候條件等影響顯著[13- 17], 目前在國內特別是西北主栽區有關于馬鈴薯連作的此類研究仍然缺乏, 且微生物群落結構在馬鈴薯連作條件下的演變特征仍不明確。針對當地因長期連作而導致的諸如立枯病、干腐病和黃萎病等真菌類土傳病害嚴重的現象, 將土壤真菌群落結構作為我們研究的重點。將輪作即未連作作為對照, 利用PCR-DGGE技術并結合真菌的18S rDNA基因測序, 比較輪作和連作條件下的馬鈴薯根際土壤真菌群落結構差異, 旨在探明和揭示馬鈴薯連作障礙的土壤原因, 以期克服和消除連作障礙, 為該地區馬鈴薯生產的可持續發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

田間試驗地點位于甘肅省中部沿黃灌區的白銀市景泰縣條山農場, 當地有充足的水源和良好的農業灌溉條件。地理坐標處于東經103°33′—104°43′, 北緯36°43′—37°38′之間, 境內海拔1274—3321 m, 屬溫帶大陸干旱氣候, 年平均氣溫為9.1 ℃, 無霜期在141 d左右。年平均降水量為185.6 mm, 年平均蒸發量為1722.8 mm。年平均日照時數2713 h, 全縣光熱資源豐富, 日照百分率62%, 太陽年平均輻射量147.8×4.184 kJ/m2, 年≥0 ℃的活動積溫3614.8 ℃, ≥10 ℃的有效積溫3038 ℃, 是我國除青藏高原外光熱資源最豐富的地區之一。供試土壤為灰鈣土, 質地為砂壤。

1.2 試驗設計與方法

在條山農場馬鈴薯種植區域內選擇連作3a(CP3)和6a(CP6)的馬鈴薯種植地塊進行田間試驗, 以玉米-馬鈴薯輪作地塊(即連作0a, 用RP表示)作為對照, 所選地塊均勻平坦整齊, 具有當地代表性, 土壤基礎農化性狀見表1。馬鈴薯栽培種植和施肥量均保持一致, 采用寬壟雙行覆膜種植, 播種前一天切種薯, 并用高錳酸鉀浸泡消毒, 壟寬1.35 m, 行距70 cm, 株距17 cm, 種植密度5605株/667m2。氮肥用量為210 kg N/hm2, N∶P2O5∶K2O比例為1.4∶1.0∶2.0, 化肥分別用15- 15- 15的復合肥、尿素和硫酸鉀。播種和施肥過程均采用機械化一次進行, 而后由人工覆膜。不施用有機肥, 且所有化肥均在播種時一次性基施, 無追肥, 其余栽培、灌溉和田間管理措施均按農場習慣方法統一進行, 各地塊保持一致。4月25日播種, 8月30日收獲。供試材料為當地主栽的加工型馬鈴薯品種大西洋, 由條山農場提供。

表1 供試土壤耕層農化性質Table 1 Detailed description of 0—20cm topsoil agro-chemical properties before sowing of 2011 potato growing season in this study

1.3 樣品采集與分析

2011年馬鈴薯播種前采集土壤基礎土樣, 測定耕層土壤的基本農化性狀。在馬鈴薯收獲時, 采用樣方取樣法, 在每個連作地塊隨機劃取3個樣方, 分別代表3次重復, 每個采樣方內選擇健壯程度和長勢一致的無病害馬鈴薯植株5株, 使用鐵鍬在盡量不破壞根系的前提下將植株整株挖出, 采集根際土壤樣品。采用抖土法取樣[18- 19], 每個樣方的5株馬鈴薯根際土壤樣品混合均勻, 每個處理得到3個混合樣本, 代表3次重復, 密封好后貯存于-80 ℃冰箱中待提取土壤DNA。成熟收獲時, 進行實測計產, 調查農藝性狀, 而后將植株整株挖出, 分根、莖、葉和塊莖四部分在105 ℃下殺青30 min, 80 ℃烘干, 稱量干物質。

1.4 PCR-DGGE技術研究土壤真菌群落結構1.4.1 土壤DNA提取

采用美國Mobio Laboratories公司生產的Mobio核酸純化試劑盒提取土壤DNA, 稱取0.25 g混勻土壤裝入提取柱中, 按照產品說明書上的步驟提取100 μL土壤DNA。同時采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行DNA提取效果的檢測, 提取的土壤DNA總量大約在23 Kb左右。

1.4.2 真菌的PCR反應條件

真菌的PCR反應采用18S r DNA基因特異性通用引物: GC-Fungi (5′>CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG<3′) 和NS- 1 (5′>GTAGTCATATGCTTGTCTC<3′)[20]。PCR反應體系為25 μL, 其中1 μL模板, 2 μL 2 mmol/L dNTPs, 2.5 μL10× PCR-buffer, 2.5 μL 25 mmol/L Mg2+, 0.3 μL Taq DNA polymerase, 引物各0.5 μL, ddH2O為15.7 μL。 PCR反應條件: 預變性94 ℃ 5 min, 繼而94 ℃ 45 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 32個循環, 最后72 ℃延伸5 min, 10 ℃保溫。所得產物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測, 真菌DNA的PCR產物片段長度在370 bp左右。

1.4.3 土壤真菌群落結果的DGGE分析

真菌PCR產物通過濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠, 變性梯度為25%—40%, 在D-Code DGGETM系統(Bio-Rad)中進行電泳, 條件為80 V, 恒溫60 ℃, 在1× TAE中電泳16 h。電泳結束后進行銀染, 膠片用加拿大產的Win RHIZOTM掃描系統成像, 所得圖像分辨率為14159×23279。譜帶分析采用Bio-Rad公司的凝膠定量軟件Quantity One (4. 6. 2版)。

1.4.4 真菌多樣性指數計算

多樣性指數H的計算方法如下[11]:

式中,Pi=ni/N,ni為DGGE泳道第i條泳帶亮度峰值高度,N為泳道中所有泳帶亮度峰值高度的總和。

1.4.5 真菌DGGE圖譜的條帶測序及分析

將DGGE膠上的DNA條帶用無菌解剖刀切下后, 加入50 μL無菌水, 4 ℃靜置過夜。然后用不含GC夾子的引物進行PCR擴增, 擴增體系同1.4.2的描述, 擴增后的PCR產物用AxyprepTMDNA Gel Extraction Kit(中國浙江)純化試劑盒進行純化。采用PMDTM19-T Vector(TaKaRa Biotechnology Dalian Co., Ltd.)連接純化后的PCR產物。而后制備EscherichiacoliDH5α感受態細胞。取200 μL感受態細胞與10 μL連接好的DNA混勻, 冰浴放置30 min, 不時輕柔搖動。42 ℃靜止水浴90 s, 迅速放回冰中繼續冰浴2 min, 加入800 μL的LB液體培養基, 于37 ℃搖床上100 r/min培養1 h, 在含有終濃度為100 μg/mL氨芐青霉素和40 μg/mL X-GAL的LB培養基平板上, 吸取100 μL培養液涂布, 共涂布3個平板, 37 ℃培養12—16 h, 觀察藍白斑, 白色菌落為陽性。挑取白色陽性克隆, 在含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體試管中37 ℃培養過夜, 采用PMD19RV-M (5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG- 3′)和PMD19M13- 47(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGT CACGAC- 3′)進行菌液PCR擴增。擴增體系為: 10× Buffer 2.5 μL, dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL, 引物(2.5 mmol/L)各 0.5 μL, MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μL, 模板(菌液) 2 μL, Taq DNA聚合酶0.5 U, 加ddH2O補足至總體積25 μL。反應條件: 95 ℃預變性10 min, 進入熱循環, 95 ℃變性1 min, 54 ℃退火1.5 min, 72 ℃延伸2 min, 共35個循環, 72 ℃保持10 min。PCR產物送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序, 將測序結果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov在線查詢分析, 利用Blast軟件在GenBank中與其它的18S rDNA序列進行同源性比較。

1.5 數據處理

用SPSS 19.0數據處理軟件對試驗數據進行統計分析, 不同處理之間數據的多重比較采用Duncan新復極差方法完成; 圖表繪制在Excel 2007軟件上進行。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯塊莖產量和植株田間農藝性狀

馬鈴薯收獲時, 對塊莖產量和產量構成因素以及植株的農藝性狀進行調查, 結果如表2所示。可以看出, 同RP相比, 連作顯著降低了馬鈴薯塊莖產量, CP3和CP6分別降低47.83%和83.62%, 而CP6較CP3也顯著下降了68.60%。單株結薯數、單株結薯重量和平均單薯重是表征馬鈴薯塊莖產量的重要指標。從表2可以看出, RP和CP3之間單株結薯數無顯著差異, 而CP6的單株結薯數較RP顯著下降了39.56%; 在單株結薯重量上, CP3和CP6較RP均有顯著的下降, 降幅分別為31.30%和70.23%; 而在平均單薯重量上, CP3和CP6較RP也分別顯著下降了35.00%和55.00%。統計分析表明, 本試驗中馬鈴薯塊莖產量的大幅度下降是3個產量構成要素共同下降造成的。3個處理的塊莖產量與單株結薯數(R2=0.3524,P=0.0419)、單株結薯重量(R2=0.9226,P<0.0001)和平均單薯重量(R2=0.7454,P=0.0011)均有著顯著或極顯著的線性相關關系。馬鈴薯植株田間生長也受連作影響, 但其影響程度因連作歷史不同而異。在植株的株高和主莖數上, CP3較RP均無顯著差異, 而CP6在這兩項指標上較RP分別顯著下降了27.67%和30.07%。而在植株莖圍上, 3個處理間無顯著差異。

表2 輪作和連作條件下馬鈴薯塊莖產量和植株農藝性狀的比較

Table 2 Comparison on tuber yield and field agronomic characteristics of potato plants under rotation and continuous monocropping system

同列不同字母表示差異5%顯著水平

2.2 馬鈴薯植株生物量

表3為3個處理馬鈴薯植株整株和不同器官的生物量以及根冠比和收獲指數的比較。可以看出, 同輪作相比, 連作馬鈴薯顯著降低了植株生產力。同RP相比, CP3和CP6的整株生物量均有顯著的下降, 降幅分別高達39.52%和74.57%; 而就不同器官而言, 其生物量較RP也均有不同程度的下降, 特別是塊莖的生物量, CP3和CP6較RP分別顯著下降了41.37%和77.79%, 表明馬鈴薯植株的經濟生產力受連作影響嚴重。同時從表3中可看出, 植株的根冠比和收獲指數也受連作影響, 但其影響程度同樣也因連作歷史不同而異。CP3的植株根冠比和收獲指數同RP相比無顯著差異; 而CP6的根冠比較RP和CP3則分別顯著增加74.29%和43.53%, 收獲指數較RP和CP3也分別顯著下降13.25%和9.69%, 表明同輪作相比, 長期的馬鈴薯連作導致了植株干物質分配上的差異。另外, 3個處理的塊莖產量與根冠比(R2=0.6704,P=0.0011)和收獲指數(R2=0.7108,P=0.0006)均有著極顯著的線性相關關系。

表3 輪作和連作條件下馬鈴薯植株生物量的比較Table 3 Comparison on biomass of potato plants under rotation and continuous monocropping system

表中生物量數據均為干重，根冠比為根系生物量與地上莖和葉片的生物量之和的比值，收獲指數為塊莖生物量與植株整株生物量的比值

2.3 馬鈴薯根際土壤真菌DGGE圖譜分析

微生物是反映土壤質量的重要指標, 土壤功能的發揮與微生物群落組成和結構聯系密切[21- 22]。本研究應用DGGE技術分離真菌18S rDNA片段的PCR產物, 不同DNA片段遷移為若干條帶, 其DGGE圖譜如圖1所示。采用Bio-Rad公司的凝膠定量軟件Quantity One對真菌DGGE圖譜進行生物信息學分析發現, CP3和CP6根際土壤樣本的真菌條帶數量和多樣性指數較RP均無顯著性差異(表4)。盡管3個處理在塊莖產量和植株生物量上存在顯著差異, 但根際土壤真菌的種群數量和多樣性特征并未因連作而產生顯著的改變。聚類分析的結果如圖2所示, 表明RP根際土壤的真菌群落與CP6有著更高的相似性。

圖1 馬鈴薯根際土壤真菌18S rDNA片段的PCR產物DGGE圖譜

2.4 馬鈴薯根際土壤真菌條帶的基因測序分析

相同遷移位置的DGGE條帶在明暗程度上的差異能夠直接地反映土壤中特定種或屬的微生物的生長趨勢變化[23]。受相同土壤質地和氣候類型及環境因子的影響, 不同土壤樣本之間具有的許多共同的DGGE條帶, 這是因為供試土壤存在一些共有的微生物類型, 然而這些公共條帶的亮度也不相同; 另外, 一些非公共條帶也在特定泳道中出現, 表明較同輪作相比, 連作馬鈴薯對根際土壤真菌群落結構的改變在DNA水平上已有所體現, 并且真菌種群間的協同演替機制也受連作影響。為了進一步地判斷不同種屬的真菌在輪作和連作條件下的行為特征, 我們對DGGE圖譜上的條帶進行了割膠回收并測序, 詳細結果如表5所示。條帶F1、F4、F5、F7、F10、F12、F14和F20被鑒定為不可培養未知真菌。F9和F29被鑒定為不可培養的燒瓶狀屬未知真菌。F13和F17被鑒定為不可培養的未知真核生物。條帶F2被鑒定與內生根毛霉具有較高的同源性(99%)。F6被鑒定為艾美蟲科的原生生物(同源性98%)。F8被鑒定為栗色單格孢(同源性99%)。條帶F11代表的微生物與白鼻癥真菌具有100%的同源性。條帶F15代表的真菌種類在數據庫比對中與羅耳阿太菌具有最相近的親源關系, 但是同源性相對較差, 只有90%。條帶F16代表的微生物與Cladosporiumbruhnei(Accession no. GU999983)具有100%的同源性, 其為枝孢霉屬真菌的一種。F27被鑒定為棕色枝頂孢(同源性98%)。條帶F18和F30均被鑒定為大麗輪枝菌(Accession no. DQ016556, 同源性均為99%), 為土蟲兆屬節肢動物的一種。另外, 與馬鈴薯病害有關的一些真菌致病菌也在基因測序鑒定中被發現。條帶F21和F22被鑒定為鐮刀屬的某些真菌(Accession no. FJ613599, 同源性分別為100%和99%), 鐮刀菌是引起馬鈴薯干腐病、枯萎病的主要土傳病害病原菌。F23被鑒定為茄病鐮刀菌(Accession no. JN166424, 同源性為99%)。條帶F24-F26均被鑒定為大麗輪枝菌(Accession no. AF104926, 同源性為97%—99%)。馬鈴薯黃萎病俗稱“早死病”, 即是主要由輪枝菌屬的大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的一種嚴重的土傳及種傳病害, 寄主范圍達160種植物[24- 25]。

表4 輪作和連作條件下馬鈴薯根際土壤真菌DGGE圖譜條帶數量和多樣性指數的比較

Table 4 Comparison on band number and diversity index within fungal DGGE profiles of rhizosphere soils under rotation and continuous monocropping system

處理Treatment條帶數量Bandnumber多樣性指數DiversityindexRP23±1.53ab3.19±0.06abCP326±0.78a3.26±0.02aCP623±1.15b3.10±0.05b

圖2 馬鈴薯根際土壤樣本的18S rDNA 條帶圖譜的聚類分析

表5 真菌18S rDNA片段測序結果Table 5 The sequences of 18S rDNA fragments for selected bands within DGGE profile

從DGGE圖譜中可以看出, 在總共的9個泳道中, F21—F26所對應的相同遷移位置的條帶在亮度上均有所變化, 表明這些微生物的生長受輪作和連作影響明顯, 為了進一步了解其在數量上變化, 使用Quantity One軟件將不同條帶的亮度峰值高度提取出來并作為該種微生物數量的相對表征量, 進而統計分析, 結果如表6所示。RP的3個根際土壤樣本的DGGE泳道中對應Fusariumsp.和Fusariumsolani的3個DNA遷移位置均未檢測到條帶; 在CP3的泳道中只在一個DNA遷移位置檢測到條帶出現; 而在CP6的泳道中3個DNA遷移位置均檢測到條帶且具有不同的亮度峰值高度, 這表明同輪作相比, 長時間的連作增加了馬鈴薯根際土壤中鐮刀屬真菌的種群數量及其個體數量。統計分析顯示, F24和F25所對應的DGGE條帶的亮度峰值高度均表現為連作顯著高于輪作, 表明馬鈴薯連作較輪作相比能夠顯著增加兩種不同Verticilliumdahliae的數量; 而F26對應的DGGE條帶的亮度峰值高度在3組供試的馬鈴薯根際土壤樣本間無顯著變化, 該結果表明馬鈴薯的連作在微生物個體水平上對Verticilliumdahliae產生影響, 而這種影響具有種間選擇性, 推測這可能與供試土壤在理化性狀上的局部空間異質性和Verticilliumdahliae的種間生理差異有關。

表6 供試土壤的真菌DGGE圖譜F1—F26條帶的亮度峰值高度的比較Table 6 Comparison on OD value of F1—F26 bands within fungal DGGE profile of rhizosphere soils

3 討論

田間試驗的結果表明, 同輪作相比, 連作顯著降低了馬鈴薯的塊莖產量和植株生物量, 并且隨著連作年限的延長, 連作障礙的表現也愈加突出。同RP相比, CP3的塊莖產量和植株整株生物量分別下降48.73%和39.52%; 而CP6的塊莖產量和植株整株生物量較CP3進一步下降68.60%和58.27%。另外, 長期的連作也造成馬鈴薯植株在根冠比和收獲指數上的顯著變化, CP6植株的根冠比較RP顯著增加74.29%, 而其收獲指數較RP則顯著下降13.25%, 表明馬鈴薯植株的干物質分配受連作影響, 這同王晶英等[26]在連作大豆和吳正鋒等[27]在連作花生上的研究結果一致。根冠比的調整被認為是作物應對生物或非生物逆境的最基本的適應策略之一, 而因長期連作而引起的土壤在理化或生物學性質上的改變應是導致根冠比出現受迫性變化的直接原因。作物連作障礙的原因傳統上被認為是土壤的頹敗所導致, 這常常被描述為作物的忌地現象。在早前的報道中, 大量的學者從土壤理化性質入手開展研究, 目前已取得一些共性的結論, 證明連作后會造成土壤酸化加劇, 土壤結構破壞嚴重, 表現為容重增大, 土壤通氣孔隙比例相對降低, 土壤含鹽量逐漸增加, 有次生鹽漬化的傾向, N、P、K的比例失調甚至根際虧缺, 同時土壤酶活性也顯著下降[28- 32], 這些結果從本試驗的供試土壤基礎農化性質中也有所體現。

隨著認識的加深和學科間的交叉融合, 學者們將根際微生態的概念應用到連作障礙的研究中來, 而微生物作為根際微生態系統的重要組成部分因此受到格外地關注。本試驗采用PCR-DGGE的手段研究連作土壤的真菌群落結構特征, 將分子生物學技術引入到馬鈴薯連作障礙的研究中, 目前在西北地區尚屬首次。結果表明, 同輪作相比, 連作并未造成馬鈴薯根際土壤真菌種群數量和多樣性的顯著變化, 這與Li等[9]使用同樣的方法在東北地區連作大豆的研究結果一致。但Yao等[10]連作大棚黃瓜的研究表明連作種植較輪作相比顯著降低了微生物的豐富度和多樣性, 并認為這種多樣性的降低可能是土壤有機質的數量和質量及分配上的差異所造成的。尤孟陽等[33]關于大豆、玉米和小麥的研究已證實, 連作導致土壤有機碳組分在空間上的重新分配, 改變了土壤碳的賦存特征, 特別是連作與自然恢復相比顯著降低了土壤游離態輕組有機碳的含量。Eskelinen等[34]的研究進一步證明土壤有機質的質量顯著影響微生物的群落組成和結構, 二者之間具有良好的線性相關關系。然而就本試驗而言, 微生物群落結構對馬鈴薯連作的響應行為是否直接與土壤有機質的變化有關, 特別是與對種植管理方式較敏感且轉化速度相對較快的的土壤輕組有機質有關尚需進一步地研究。而之所以會出現以上不一致的研究結果, 一方面可能受供試土壤類型和試驗區生態環境條件影響, 因為二者直接決定了作物根際的土著微生物的種類, 不同種屬或功能型的微生物對連作的敏感性和耐受性也截然不同; 另一方面應與供試作物品種有關, 這直接體現在根系分泌物種類和數量上, 根系分泌物能夠顯著影響根際微生物的活性和組成結構, 其任何細微的改變均能對根際微生物產生深遠影響[35- 36], 盡管目前研究者對根系分泌物和微生物之間的互饋機理仍然缺乏足夠的認識。

本研究表明, 盡管輪作和連作條件下馬鈴薯根際土壤真菌在種群數量和多樣性上無顯著差異, 但DGGE圖譜分析也充分證明二者在真菌群落組成結構上差異明顯, 這可以從各條泳道的條帶亮度差異上體現出來。表明同輪作相比, 連作能夠顯著影響作物根際真菌群落結構, 而早前在不同作物上的相關報道[8- 10]也證實了這個結論, 并認為這可能與作物連作障礙的產生有關。通過對DGGE條帶進行割膠測序分析, 與馬鈴薯土傳病害有關的致病菌被鑒定出來, 如Fusariumsp.和Fusariumsolani以及Verticilliumdahliae。不同條帶的亮度峰值高度統計結果表明, 馬鈴薯的連作較輪作相比導致了鐮刀屬真菌在根際土壤中的富集, 而這在種群數量和個體數量上均有所體現。由鐮刀菌引起的干腐病是馬鈴薯貯藏期常見的真菌性病害之一, 在病薯中該病害所占比例較高[37]。牛秀群等[38]在與本試驗相同的研究區域采用微生物平板培養的方法也得出了類似的結果, 同時也證明隨著連作年限的增加, 馬鈴薯根際土壤不同鐮刀菌種的數量變化趨勢各異, 尖孢鐮孢、茄病鐮孢呈上升趨勢, 黃色鐮孢、再育鐮孢呈下降趨勢, 木賊鐮孢變化較為平穩。尖孢鐮孢和茄病鐮孢一般都具有強寄生能力, 生活適應性也較廣, 在澳大利亞、南非、美國等地都有嚴重發病的報道, 是致病力強的土傳病害病原[39]。由于DGGE技術的固有特點和DNA序列比對的精準度問題, 本研究結果只能將微生物準確定義到屬的水平, 因而在下一步的研究當中, 將傳統微生物平板培養和定量PCR甚至高通量的土壤基因組測序等精準的分子生物學技術相結合能有助于人們在更細微的微生物分類學水平上來理解連作和輪作馬鈴薯根際土壤的真菌群落的結構性差異。

Verticilliumdahliae是導致植物黃萎病的主要致病菌。本試驗結果同時表明, 同輪作相比, 馬鈴薯的連作也導致了根際土壤Verticilliumdahliae(Accession no. AF104926, 同源性為98%—99%)數量的增加。有關于Verticilliumdahliae拮抗菌的篩選和應用研究目前也有較多的報道, 主要以Bacillussubtilis為主, Luo等[20]和Lang等[11]通過將篩選到Bacillussubtilis經二次固體發酵結合到有機類肥料中進而施用到作物根際達到了較好的抑制作物土傳病害的目的。類似的研究如Zhang等[40]在黃瓜的枯萎病和Zhao等[41]在甜瓜的枯萎病上均有積極的報道, 這種將外源拮抗微生物引入到作物根際并結合充足的有機碳氮源補給實現其在根表的有效定殖的對土傳病害的生防策略也為我們在甘肅省中部沿黃灌區的馬鈴薯連作障礙土壤機理研究和連作障礙的防控研究中提供了新的思路。馬鈴薯的長期連作是否也會導致植株根際土著的有益微生物在種群數量或個體數量上的減少, 功能多樣性的衰退? 另外, 本研究中通過DGGE技術和DNA測序觀察到的一些與馬鈴薯土傳病害有關的致病菌數量的增加是否對應著根際有益微生物數量的減少, 二者是否存在協調一致的關系? 這些猜測均需進一步地研究核實。

4 結論

馬鈴薯的連作種植較輪作顯著降低了塊莖產量和植株的生物量以及經濟生產力, 也改變了植株干物質在地上和地下器官的分配。與輪作相比, 連作馬鈴薯根際真菌的種群數量和多樣性無顯著差異, 但真菌群落結構上發生了顯著地變化, 這可能造成試驗區馬鈴薯連作障礙產生的原因之一。此外, 馬鈴薯連作增加了一些與土傳病害有關的真菌致病菌的種群或個體數量, 如Fusariumsp.和Fusariumsolani以及Verticilliumdahliae, 但其作用機制尚需進一步地研究。

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Middle Gansu Province

LIU Xing1, QIU Huizhen1,*, WANG Di2, ZHANG Junlian2, SHEN Qirong3

1CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,GansuProvincialKeyLabofAridlandCropScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China2CollegeofAgronomy,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China3CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

The yellow river irrigation areas of middle Gansu Province is one of the main processing potato growing regions in the Northwest China. Potato is often grown continuously by Gansu farmers and planting enterprises eager to maximize consecutive payoffs. This practice results in the severe decline in tuber yield and loss of tuber chemical qualities. Field studies was conducted to evaluate the differences in fungal community structure of rhizosphere soils of potato between rotation and continuous cropping systems in order to find the new evidence for the study on continuous cropping obstacle in Yellow River Irrigation Areas of Middle Gansu Province. In experimental site, three potato planting plots nearby each other were selected for this research, one is the rotation plot, namely, non continuous potato cropping, and two other plots had been continuously planted potato over 3 and 6 years, respectively. Rhizosphere soil samples were collected at 2011 potato harvest time, and then soil DNA was extracted. Subsequently, polymerase chain reaction (PCR)-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) was performed to analyse fungal community structure. The results revealed that continuous potato cropping significantly decreased tuber yield and plant biomass compared with potato rotation, and more seriously with the continuous potato cropping duration. In addition, continuous potato cropping over long-term significantly increased the ratio of root to shoot and also caused the decline in economic productivity of potato crop. There were no significant differences in fungal population quantity and diversity indices of rhizosphere soils between rotation and continuous cropping systems, whereas the obvious shift in community structure occurred. Sequence analysis of fungal 18S rDNA gene confirmed that continuous potato cropping increased population quantity or individual number ofFusariumsp. andFusariumsolanias well asVerticilliumdahliae. Our results suggested that the decline of tuber yield and plant biomass in continuous potato cropping system might be associated with the change in fungal community structure of rhizosphere soils of potato, especially the increase in pathogen dynamic.

potato; rotation and continuous cropping; fungal community structure; microbial diversity

公益性行業(農業)科研專項(201103004); 國家科技支撐計劃(2012BAD06B03); 國家馬鈴薯產業技術體系(CARS- 10-P18); 甘肅省科技重大專項(1102NKDA025)

2013- 08- 21;

2014- 07- 02

10.5846/stxb201308212122

*通訊作者Corresponding author.E-mail: hzqiu@gsau.edu.cn

劉星, 邱慧珍, 王蒂, 張俊蓮, 沈其榮.甘肅省中部沿黃灌區輪作和連作馬鈴薯根際土壤真菌群落的結構性差異評估.生態學報,2015,35(12):3938- 3948.

Liu X, Qiu H Z, Wang D, Zhang J L, Shen Q R.Evaluation on fungal community structure of rhizosphere soils of potato under rotation and continuous cropping systems in Yellow River Irrigation Areas of Middle Gansu Province.Acta Ecologica Sinica,2015,35(12):3938- 3948.