椎間盤脫出模型大鼠脊髓血管生成因子mRNA的表達變化及電針對其影響

吳偉澎，李偉，程鵬，姜代勛，陳武

(1．北京農學院獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室;2．北京農學院動物科學技術學院，北京 102206)

椎間盤脫出是人和動物常見病，針灸療法顯示了良好的療效。髓核脫出壓迫脊髓導致機能障礙與微循環障礙和微血管數量變化密切相關［1］。本實驗室前期研究表明椎間盤脫出壓迫模型大鼠的脊髓微血管數量異常減少，而電針組能夠改善這種異常變化［2］，但其機理不明。血管生成因子與血管生成抑制因子、血管破壞因子之間的動態平衡是維持微血管的數量和結構穩定性的重要因素［3］，本研究通過觀察血管生成因子血管生成素1 (angiopoietin-1，Ang-1)、血管生成素2 (angiopoietin-2，Ang-2)、血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及它們的受體Tie-1、Tie-2、Flt-1，血管生成抑制因子凝血酶敏感蛋白1 (thrombospondin-1，Tsp-1)，細胞凋亡因子caspase-3 在脊髓受壓損傷后表達量的變化以及電針對其的影響，為針灸治療椎間盤病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

東華牌電針治療儀(WQ-6F);毫針(蘇州天協針灸器械有限公司，規格0.2 ×25 mm);微動力儀(Surgic XT，NSK，Japan);Step One Plus 熒光定量PCR 儀(ABI);戊巴比妥鈉(北京化學試劑公司，德國進口分裝);注射用青霉素鉀160 萬單位、注射用硫酸鏈霉素50 萬單位;TRIzol (Invitrogen);Revert Aid TM First Stand cDNA Synthesis Kit (Thermo);Trans Start Grenn qPCR Super Mix (Trans Gen Biotech)。

1.2 實驗動物分組

清潔級雄性SD 大鼠18 只，體重180 ～200 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供【SCXK-(軍)2012-004】，實驗在北京農學院屏障動物實驗設施進行【SYXK (京)2010 -0003】，并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。實驗動物隨機分成三組，即電針治療組(n =6)、模型組(n=6)、假手術對照組(n =6)。電針組和模型組進行脊髓壓迫，假手術組只暴露脊髓不壓迫。電針組進行電針治療，對照組和假手術組不做任何治療。

1.3 椎間盤脫出模型制作

大鼠椎間盤脫出模型參考文獻［4］，腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/(kg·bw)進行麻醉，俯臥保定，以胸腰段椎體為中心剃毛、消毒，以第一腰椎(L1)為中心，沿背正中線切開皮膚約2 cm，分離筋膜、背最長肌、多裂肌，充分暴露L1的棘突、椎板和關節突，微動力儀小心打磨椎板，暴露脊髓背側，將自制的硅膠片從L1的左側填塞入至T13段脊髓的左腹側位，假手術組則只暴露脊髓，不進行壓迫。分層縫合肌肉、皮膚關閉切口。術后每只大鼠肌肉注射青霉素鉀30 000 U/(kg·bw);硫酸鏈霉素15 mg/(kg·bw)，2 次/日，連用3 d。單獨分籠飼養，正常供給飲水和飼料，人工幫助排尿、排便，每日三次。

1.4 穴位選取與電針方法

電針治療組，根據本課題組前期研究，選用以下三組穴位:左右膀胱俞(BL28);左側足三里(ST36)、趾間(EX-LE10);右側足三里(ST36)、趾間(EX-LE10)，每組分別接通電針儀，頻率2 Hz，幅度為5，每天一次，每次20 min，連續治療7 d。

1.5 運動機能評分

采用BBB 運動機能評分法［5］，于術前、術后每日，對大鼠左、右后肢分別進行運動機能評分，其中第1 天在大鼠從麻醉狀態完全清醒后開始評分。

1.6 標本收集

術后第7 天，在麻醉狀態下，500 mL 生理鹽水進行心臟灌注，在冰塊上快速取出脊髓，從壓迫正中向頭側取3 mm 用于RT-PCR 檢測，向尾側取3 mm用于病理學檢測。

1.7 病理學檢測

脊髓組織在4%多聚甲醛中固定24 h，常規脫水、組織包埋、切片、HE 染色，顯微鏡下觀察脊髓損傷情況。

1.8 RT-PCR 檢測

取50 mg 脊髓組織，用TRIzol 提取總RNA，按RevertAid TM First Stand cDNA Synthesis Kit 說明書反轉錄為cDNA，根據文獻［6，7］選取與血管生成相關因子引物(見表1)，擴增條件:95℃預變性2 min;94℃20 s;57 ～63℃20 s;72℃30 s，循環40 次。拷貝CT 值，采用2－ΔΔCt法進行分析。

表1 血管生成相關因子基因引物Tab．1 The primers of the related-angiogenic genes

1.9 分析方法

2 結果分析

2.1 電針對椎間盤脫出模型大鼠后肢運動機能的影響

造模后大鼠的運動機能評分迅速降為零，隨著時間的延長，后肢運動機能逐漸恢復(見圖1-A，B)。對第1、4、7 天數據進行統計分析，由圖1-C 和圖1-D 可知，在第4 天和第7 天，電針組大鼠的左、右后肢運動機能評分極顯著高于模型組(P ＜0.01)。電針組第7 天大鼠的左、右后肢運動機能評分極顯著高于第4 天(P ＜0.01);模型組第7 天大鼠的左后肢運動機能評分與第4 天相比差異無顯著性(P ＞0.05)，第7 天右后肢運動機能評分顯著高于第4 天(P ＜0.05)。表明電針能顯著改善椎間盤脫出模型大鼠的后肢運動機能。

2.2 組織病理學變化

電針組神經元多完好，尼氏小體可見，灰質與白質分界明顯，軸索與髓鞘多完整排列有序，偶見空泡化。模型組，神經元少見且多損傷，尼氏小體消失，灰質與白質邊界模糊不清，殘存的白質中可見到不完整的軸索和髓鞘，多空泡化(見圖2)。

2.3 電針對血管生成相關因子的mRNA 表達的影響

由圖3 可知，模型組與假手術組相比Ang-1、Ang-2、Tie-1、Tie2、caspase-3、Tsp-1 極顯著升高(P ＜0.01)，VEGF、Flt-1 差異無顯著性(P ＞0.05);模型組與電針組相比Ang-2、Tie-1、Tie2、caspase-3、Tsp-1極顯著升高(P ＜0.01)，Ang-1、VEGF、Flt-1 無顯著性變化(P ＞0.05);電針組與假手術組各指標差異均無顯著性(P ＞0.05)。結果顯示，模型組Ang-2、Tie-1、Tie2、caspase-3、Tsp-1 的mRNA 的表達量異常高于假手術組和電針組，電針組與假手術組各指標差異均無顯著性，提示電針能維持血管生成相關因子的mRNA 表達的相對穩定并使之接近機體正常水平。

圖1 電針對椎間盤脫出模型大鼠后肢運動機能的影響Fig．1 Effects of electroacupuncture on the hind limb motor function in the rat models of intervertebral disc herniation

圖2 電針組(A)，假手術組(B)，模型組(C)，脊髓腹角形態學觀察(標尺=50 μm)Fig．2 Pathological changes in the anterior horn of spinal cord in the rats of the electroacupuncture group(A)，sham operation group (B)，and model group (C)．HE staining，bar=50 μm．

圖3 電針對血管生成相關因子mRNA 表達的影響Fig．3 Effects of electroacupuncture on the changes of mRNA expressions of angiogenesis-related factors

3 討論

脊髓血管能為脊髓組織運送營養物質，同時移除組織代謝產物，對受損脊髓組織的修復意義重大。而血管結構的穩定與血管生成因子和血管生成抑制因子與細胞凋亡因子關系密切［8］。

脊髓組織受到打擊、壓迫等損傷后，受損部位出血、水腫、缺氧，局部組織穩態受到破壞，導致大量鈣離子內流，自由基大量產生，單胺類物質大量釋放，致使血管收縮，脊髓微血管灌注量顯著下降，進一步加劇組織缺血缺氧的狀態［9］。在低氧環境下機體過量表達的缺氧誘導因子-1α (hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)與VEGF 基因轉錄啟動子的結合位點結合，促進VEGF 的表達［10］。VEGF 能促進血管內皮細胞的增殖和遷移，促進血管的新生。新生血管由于缺少血管周細胞和基質細胞，結構穩定性差，滲透性增強，加劇組織出血與水腫，造成脊髓組織二次損傷［11］。在本次試驗中，模型組VEGF 和Flt-1 的表達量有所上調，但與電針組和假手術組相比無統計學意義。

Tie-1、Tie-2 是一類酪氨酸受體，Tie-1 能維持血管內皮細胞結構及功能的完整性，促進新生血管的成熟，其配體目前仍不十分清楚;Tie-2 的配體為Ang-1 和Ang-2［12］。Ang-1 和Ang-2 能競爭性與Tie-2 結合并與VEGF 協同作用，參與血管新生，并且在維持新生血管的穩定性中發揮重要作用。Ang-1 與Tie-2 結合時表現為維持血管結構正常;Ang-2 與Tie-2 結合表現為打破血管的正常結構，當在VEGF高度表達的環境下，Ang-2 與Tie-2 結合有利于內皮細胞遷移，促進血管新生，反之則表現為血管的退變［13］。本研究結果中，模型組的Ang-2 與Tie-2 的mRNA 表達都顯著上調，VEGF 的mRNA 表達雖有上調，但與電針組和假手術組相比無顯著差異，提示模型組存在VEGF 低表達環境引起血管退變的因素。在VEGF 低表達環境中Ang-2 與Tie-2 的結合表現為血管退變，而在模型組Ang-2 與Tie-2 的表達顯著高于電針組(P ＜0.01)，提示電針能夠減少Ang-2 與Tie-2 的結合，從而有利于維持血管的正常結構。另外，電針組與假手術組的Ang-1、Ang-2、Tie-1、Tie-2 均無顯著差異，提示電針能夠調節Ang-1、Ang-2、Tie-2、VEGF 之間的平衡使之接近正常機體水平，維持受損脊髓的血管生成相關因子的相對穩定。本課題組前期研究表明，電針能顯著提高壓迫部位脊髓血流灌注量，促進神經機能的恢復［4］。本研究觀察到電針下調VEGF、Ang-1、Ang-2、Tie-2的表達，這可能與電針增加壓迫部位脊髓血流灌注量，緩解局部缺氧環境，減輕血管新生造成的二次損傷等相關［11］。

Tsp-1 作為強效血管生成的負性調節因子之一，能與血管內皮細胞上的CD36 受體作用，影響血管內皮細胞釋放VEGF，抑制血管內增殖、分化和遷移，從而抑制血管的生成;并能誘導血管內皮的凋亡，破壞血管結構的穩定［14］。Caspase-3 處于凋亡有序級聯反應的下游，是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點，它的活化是凋亡進入不可逆階段標志。TSP-1 能與細胞膜上的CD47 受體結合，上調Caspase-3 的表達［15］，誘導細胞凋亡。本研究結果顯示模型組Tsp-1 和Caspase-3 的表達顯著上調，而電針能極顯著降低TSP-1、Caspase-3 的mRNA 表達，提示電針能夠抑制血管生成負性調節因子的表達，從而為血管的生成和穩定提供有利環境。萬賽英等［16］研究也表明電針可以上調Ang-1 及下調TSP-1的表達，促進腦缺血區的血管的重建。余曉慧［17］等研究表明電針能通過抑制Caspase-3 在大鼠脊髓損傷神經元中表達，抑制神經細胞凋亡，減輕了脊髓繼發性損傷，促進神經功能恢復。

脊髓壓迫損傷后血管生成相關因子mRNA 表達異常，電針能夠下調Ang-2、Tie-2、Tsp-1 和Caspase-3 的表達，從而使血管生成促進因子和抑制因子趨于正常水平，為受損脊髓組織修復提供有利條件。

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