一種gRNA快速合成及檢測方法的建立

杜建勇，鄧然，高虹，雍偉東

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

基因定點敲除技術通過對染色體上基因特異位點進行定點突變，使其功能喪失，進而達到研究其功能的目的。一些利用基因敲除技術創建的動物疾病模型對醫學研究的發展做出了重要貢獻。傳統基因敲除技術于上世紀80年代末由Smithies 等［1］創立，通過同源重組手段將構建的外源DNA 片段插入并替換相應染色體上特定的區段，達到基因敲除的目的。這一技術的應用使人類能夠有目的地研究基因功能和與之相關的疾病之間的直接關系。然而由于同源重組技術需要載體構建、ES 細胞打靶、篩選、顯微注射、小鼠鑒定等一系列較為復雜的操作步驟，并且成本較高、周期較長，大大限制了這一技術的應用。針對同源重組的缺點，科學家一直在探索用其他更簡便的技術來實現基因敲除。先后發明了ENU 隨機突變、基因捕獲、ES 細胞基因敲除細胞庫等方法和手段，但由于技術手段和操作成本的限制，這些技術都不能完全替代傳統的同源重組技術。2009年以后出現了一系列新的基因編輯技術，包括ZFN、TALEN 和CRISPR/Cas9，開創了基因敲除(敲入)新的時代。這些新基因編輯技術作用原理相似，即通過核酸酶在目的基因的DNA 雙鏈上制造切口，然后利用生物體自身的修復機制以同源重組或者非同源末端連接的方式實現修復，進而達到基因失活的目的。作為一種最新的基因編輯技術，CRISPR/Cas9 技術通過gRNA 識別特異的靶序列，同時介導Cas9 核酸酶在DNA 的特異位點上制造切口［2］，然后利用生物體自身的修復機制進行DNA 修復。這一過程中可能造成堿基改變、增加、缺失等突變現象，進而實現對目的基因的敲除與修飾［3］。

CRISPR/Cas9 系統的高效基因組編輯功能已被成功應用于多種生物。包括人類細胞［4］，斑馬魚［5］、小鼠［6，7］、大鼠［8］、植物［9，10］及細菌［11］。眾所周知，生物體的一個性狀往往由多個基因共同決定，傳統的基因敲除費時費力卻只能一次敲除一個相關基因，而CRISPR/Cas9 系統其中一個最重要的特點便是可在多個不同gRNA 的引導下由Cas9 核酸酶一次靶向敲除多個基因組位點［12，13］。與其他基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9 系統具有其獨特的優勢:首先，其RNA 識別DNA 機制即核酸之間的相互識別，避免了DNA 甲基化造成的影響。其次，與ZFN 和TALEN 相比，具有相同或更高的基因編輯效率，尤其在點突變方面優于ZFN 和TALEN［14，15］。第三，設計簡單快速，無需重復構建核酸內切酶表達載體，適用于任何分子生物學實驗室。

當前基因編輯技術迅速發展，CRISPR/Cas9 技術以其優勢必將迅速推動基因組功能的研究。快速獲取目標gRNA 并檢測驗證其活性將會推動這項技術的發展。本文旨在建立一種體外gRNA 快速合成及檢測的方法，這一方法的建立將減少利用該系統實現基因編輯的時間，快速實現目標基因的敲除。

1 材料和方法

1.1 材料

8 周齡SPF 級C57 小鼠，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供【SCXK(京)2014-0004】，PCR儀(Bio-Rad T100TM Thermal Cycler)、Tanon 全自動數碼凝膠成像分析系統(上海天能公司)、NanoDrop 2000 超微量分光光度計(Thermo)、T7 轉錄試劑盒(Ambion_mMESSAGE_mMACHINE_T7)、RNA 純化試劑盒(MEGAclearTMKit，Ambion)、PCR 產物純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit)、無核酸酶水、dNTP mixture、高保真酶Taq 酶(Sigma)、Cas9 核酸酶(北京唯尚立德生物科技有限公司)

1.2 gRNA 靶點選擇及其寡核苷酸鏈合成

利用http://crispr．mit．edu/ 設計能夠結合NKp46 外顯子Exon3 上的gRNA(20nt)。引物及gRNA 通用模板由Invitrogen 公司合成。

1.3 gRNA 轉錄模板的PCR 擴增

利用NKp46 gRNA 特異的上游引物mNKp46_g1F 和gRNA 通用下游引物gRNA-R，以人工合成的gRNA 通用模板DNA 片段為模板，通過PCR 擴增得到NKp46 基因特異的gRNA 轉錄模板。具體反應條件如下:(94℃30s，60℃10s，72℃30 s)×35，72℃10 min，4℃保存。取5 μL 電泳檢測PCR 產物，確定得到目標DNA 片段，大小為123 bp。

1.4 gRNA 模板的體外轉錄

在得到gRNA 轉錄模板后利用純化試劑盒進行gRNA 轉錄模板的純化。將純化后的產物用T7 RNAkit 轉錄試劑盒(Ambion_mMESSAGE_mMACHINE_T7)進行NKp46 gRNA 體外轉錄并利用RNA 純化試劑盒(MEGAclearTMkit，Ambion)將轉錄產物進行純化。合成的gRNA 通過NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測檢測濃度及純度。分裝并－80℃凍存。

1.5 gRNA 體外活性及特異性檢測

將得到的gRNA 與Cas9 核酸酶以及目的DNA混合孵育，電泳后觀察條帶大小并觀察片段灰度來確定切割效率。反應體系:dsDNA(4μL)，gRNA(體外轉錄)(1μL)，Cas9 核酸酶(1μL)，10 × buffer(2μL)，ddH2O(12μL)，反應總體系(20μL)按照上述反應體系，混合好反應溶液，37℃30 min，65℃5 min。

2 結果

2.1 小鼠NKP46 基因gRNA 靶點選擇

NKp46 基因存在于嚙齒類動物(大鼠和小鼠)和靈長類動物，如黑猩猩和短尾猿中。同時NKp46是唯一能被小鼠細胞上表達配體所識別的人類NK細胞激活受體。為了研究NKP46 基因在病毒感染過程中的作用，我們希望通過Cas9 技術創建NKP46敲除小鼠。利用網站http://crispr．mit．edu/，設計得到gRNA，見表1。

表1 gRNA 靶點序列Tab．1 The CRISPR target sequences

本文以小鼠NKP46 基因為例設計gRNA。共選擇了2 條gRNA 序列:

gRNA1 GGTGAACATCTGGTGTCAGG，gRNA2 CTCGGTGAACATCTGGTGTC 這兩個gRNA位于Nkp49 基因組上外顯子Exon3 處。

2.2 NKp46gRNA 體外擴增模板的設計

gRNA 轉錄模板的結構:T7 啟動子、前導序列(20nt)、保守序列。體外擴增模板序列是固定的即gRNA 轉錄模板的保守序列GTTTTAGAGCTAGA AATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC TTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT，該片段可以形成gRNA 的發卡結構，是所有gRNA 都包括的一部分。

2.3 上游引物gRNA-F 的設計

將得到的20nt 的序列前端加上一段T7 啟動子序列TAATACGACTCACTATAGGG 并在末尾加上與gRNA 固有序列前端相同的幾個堿基 GTTTTAGAGCTAG，最終設計得到一個53nt 的片段。按照該方法設計并合成了靶向小鼠NKP46 基因的mNKp46_g1F。mNKp46_g1F 將作為轉錄模板合成過程中的上游引物，參與PCR 反應。由于體外轉錄試劑盒在轉錄完成后會在5’端多出3 個G 所以在設計選擇靶向gRNA 時可以選擇起始位置帶G 的序列，這樣可以最大限度的減少體外轉錄的影響，它的構成(圖1)mNKp46 _ g1F TAATACGACTCACTA TAGGGTGAACATCTGGTGTCAGGGTTTTAGAGCTAG

圖1 上游引物結構示意圖Fig．1 Schematic diagram of the forward primer structure．The designed primer consists of three parts:T7 promoter，the target sequence (20nt)，and 13 bp gRNA conserved sequence

2.4 gRNA 合成的通用下游引物

gRNA-R 的設計AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC，該序列與gRNA 模板3’端互補。

2.5 靶向小鼠NKP46 基因的gRNA 的轉錄模板在體外完成擴增

該過程十分簡單只需一步PCR 反應就可以迅速得到足夠濃度的帶有T7 promoter 的gRNA 的轉錄模板，參與反應的上游引物已經按照上述方法設計合成，其中下游引物和模板由于是通用的不具有特異性，不需要每次都合成。當研究者更換目標基因，只需設計合成一條新的上游引物即可，下游引物及模板不需要重復合成，十分的簡單經濟。擴增過程(見圖2)。然后體外轉錄得到足夠濃度gRNA 的靶向NKP46 基因的gRNA。

2.6 體外利用Cas9 核酸酶檢測驗證該方法確實可以得到高特異性及活性的gRNA

設計體外檢測引物mNk46_gSF TCCAAACAC GTGCATGTTACACATG，mNk46_gSR CCCAGCTTTG ACTCTCTTGTCCATC 以小鼠DNA 作為模板，利用該引物可以擴增NKP46 基因，作為體外酶切檢測的片段。該片段中包含gRNA 的靶點，利用這種體外檢測方法，可以迅速對設計合成的gRNA 的特異性及活性進行檢測，通過電泳可以觀察剪切條帶的大小，以驗證靶點位置是否正確，進一步可以通過T-A 克隆檢測切開位置。本文設計的靶向NKP46 的gRNA在靶點位置切開，使得全長1297 bp 檢測條帶，被切成兩條帶，大小分別為804 bp 和493 bp(圖3A)。通過對灰度的計算(圖3B)，計算得到轉錄后原濃度的gRNA 以及稀釋一倍的gRNA，剪切效率都為100%，由此可以證明該方法設計合成gRNA 特異性及活性較高，同時體外檢測快速檢測的方法大大提高了gRNA 檢測的效率。

圖2 gRNA 的轉錄模板結構及轉錄示意圖Fig．2 A schematic diagram of the gRNA template structure and transcription

3 討論

常規獲取gRNA 要構建表達載體，需要把gRNA的轉錄模板連接到載體上，經過涂板挑選單克隆再搖菌后提取質粒，最后還要酶切使質粒線性化才能得到gRNA 的體外轉錄模板，得到gRNA 最少也需要3d 的時間。而本文建立的這種方法將極大地節約轉錄gRNA 的時間，一步PCR 反應就可以得到足夠濃度的轉錄模板，僅需半天時間就可以得到需要的gRNA。本文建立的這種活性及特異性檢測方法，可以在體外迅速驗證gRNA 的其活性及特異性。將Cas9 核酸酶、gRNA、PCR 擴增的靶基因片段混合孵育，通過瓊脂糖凝膠電泳可以十分清楚的觀察到剪切位置并通過對電泳照片的灰度比較可以進一步計算剪切效率。

建立的這種快速利用CRISPR /Cas 9 技術實現基因編輯的方法，最具特色的是gRNA 的獲得及體外酶切檢測。與常規方法相比我們不構建gRNA 表達載體而是直接利用化學合成方法。在體外合成一段單鏈DNA，通過設計引物，利用PCR 技術迅速擴增該片段，并轉錄純化得到有功能的gRNA。利用這種gRNA 快速合成及檢測的方法，可以使每次基因編輯僅需合成一段與目的基因互補的一小段DNA 鏈即一個上游引物即可，模板和下游引物都是通用的方便而經濟。本文建立的體外酶切檢測方法可以在得到gRNA 后迅速對其活性及特異性檢測，為后續轉染或顯微注射篩選有效的gRNA 節省了寶貴的時間。

圖3 體外檢測片段擴增及酶切位點示意圖Fig．3 A schematic diagram of the amplification and detection of fragments cleavage sites in vitro

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