心理應激致孕鼠乳腺發育不良及雌/孕激素和受體水平異常

王瑞瓊，吳國泰，劉峰林，魏彥明* ，吳玉泓

(1. 甘肅農業大學，蘭州 730070;2. 甘肅中醫學院，甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，蘭州 730000)

隨著集約化養殖業的發展，孕畜的生存生活環境完全處于非自然狀態，孕期乳腺發育受環境因素的影響越來越明顯［1－2］，許多外界不良因素的刺激可引起孕畜的心理應激反應，如受到驚嚇和強烈刺激等，另外棚舍低矮、陽光不足、通風不良、活動受限、冷熱刺激，強行驅趕、噪聲、慢性疼痛等環境應激都可能引起孕畜的乳腺發育障礙。初產母畜因乳腺發育不良而致無乳癥，給畜牧業的生產和效益造成嚴重的經濟損失［3］。乳腺發育是動物泌乳性能的關鍵因素，而乳腺發育受“下丘腦－垂體－卵巢”神經內分泌軸的調控［4］，雌激素(E2)、孕激素(P)、生長激素(GH)、催乳素(PRL)及其受體水平能真實反映乳腺發育的程度和狀態［5，6］，現代醫學研究發現心理應激與乳腺增生或乳腺癌的發生不一定存在直接關系，但是心理應激能導致女性內分泌紊亂，引起雌激素、孕激素水平變化，導致圍產期母體乳腺異常［7－9］。本研究基于環境異變引發心理應激，導致神經內分泌系統紊亂，進而阻礙乳腺發育的假說，研究懷孕大鼠乳腺發育與雌激素、孕激素及其受體水平變化的關系，探索規避傷害性刺激以期保護乳腺正常發育的科學方法，為相關研究和畜牧業生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級Wistar 性成熟大鼠，由甘肅中醫學院實驗動物中心提供【SCXK(甘)2011－0001】，其中雌鼠30 只，體重200 ～250 g，80日齡;雄鼠15 只，體重250 ～300g，90日齡。在本中心無特定病原體(specific pathogenfree，SPF)實驗室飼養【SYXK(甘)2011－0001】，SPF 級大鼠生長發育飼料由北京科奧協力飼料有限公司提供;室溫(20±2)℃，相對濕度(50±5)%，12 h 明暗交替，適應3d 后開始實驗，實驗過程中沒有動物死亡及流產，本實驗方案獲得甘肅中醫學院實驗動物倫理委員會批準(批準號:20131015－02)。

1.1.2 藥品與試劑

125I－E2、125I－PROG、125I－PRL 及125I－GH 放射免疫試劑盒(上海凱博生化試劑有限公司，中國)，枸櫞酸鈉抗凝劑(四川綿竹鴻基制藥有限責任公司，中國)，3H－雌二醇(3H－E2，放射比活度2.25TBq/mmol，New England Nuclear 公司)，3H－孕酮(3H－P，放射比活度150.1 GBq/mmol，New England Nuclear 公司)，考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)。其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器

培養倒立頭顯微鏡(Nikon，日本);TGL20M 醫用離心機(湖南凱達科學儀器有限公司，中國);高速冷凍離心機(Sigma，美國);HH－4 恒溫水浴鍋(金壇市豐儀器制造有限公司，中國);601－01 游標卡尺(哈爾濱量具刃具集團有限責任公司，中國);DT510H 超聲波清洗器(Bandelin，德國);DW－86L338 醫用低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司，中國);PAT－8 場景恐懼系統(成都泰盟科技有限公司，中國)，JA3003B 電子天平(上海越平科學儀器有限公司，中國);SN－659 型智能放免γ測量儀(上海應用物理所日環光電儀器有限公司，中國);高速組織勻漿機(IKA，德國);微量分光光度計(Thermo，美國);7220 紫外－可見光分光光度計(上海第三分析儀器廠，中國);LS 6500 液體閃爍計數儀(Beckman，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物篩選

實驗前，30 只雌鼠行陰道脫落細胞涂片，HE 染色，連續觀察2 個動情周期，選用有4 d 左右性周期的大鼠，將處于動情期的雌鼠與雄鼠(2∶1)于每日20:00 －22:00 隨機合籠交配，次日晨8:00 觀察陰栓情況，將發現陰栓且陰道涂片存在精子者確定為孕鼠，并定為妊娠的第1 天。

1.2.2 分組與造模

將20 只妊娠大鼠，隨機分為對照組和實驗組，每組10 只。實驗前觀察大鼠近尾端第2、3 對乳頭的外觀并用游標卡尺測量乳頭直徑及高度。對照組大鼠每籠5 只常規飼養(不給任何刺激)，實驗組大鼠單籠孤養并施加5 種不可預見性應激刺激。5 種刺激15 d 內隨機安排，每天1 種，每種刺激出現3 次且不連續出現。應激刺激操作方法:①噪音刺激:將大鼠置于PAT－8 場景恐懼系統中，選擇強度為95 dB 的聲音刺激5 min;②束縛應激:將大鼠置于固定器中(直徑5.5 cm，管壁有直徑為0.4 cm 的小孔)6 h，不擠壓大鼠尾巴;③晝夜顛倒:早7:00 時將大鼠放入密閉暗室中，關燈使動物處于黑暗狀態，晚7:00 時打開暗室照明燈(功率100 W 白熾燈)，使大鼠處于光照狀態，次日早7:00 時取出;④冰水游泳:將大鼠置于盛有4℃水池中(水深30 cm)游泳10 min;⑤夾尾致痛:固定器固定大鼠，露出尾部，用止血鉗夾住距尾尖1/3 處(使其發出叫聲但不破皮)，持續30 min。

1.2.3 檢測指標與方法

(1)乳頭直徑、高度、乳房系數

造模前后觀察乳頭外觀并用游標卡尺測量近尾端第2、3 對乳頭的直徑及高度。造模第16 天，各組大鼠腹腔注射10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，心臟取血2.0 mL 后，剝離近尾端第2、3 對乳頭皮膚，置于冰盤上，用9 mm 打孔器摘取第2、3 對乳房組織，電子天平精密稱重，計算乳房系數。乳房系數=乳房重量(g)/體重(100 g)。

(2)乳房DNA、RNA 含量檢測

取第2 對右側乳房組織，－70℃液氮凍存，待測DNA 和RNA。按文獻［10］方法提取DNA 和RNA。7220紫外－可見光分光光度計在260 nm 處測量吸收度(A)，稀釋前DNA、RNA 的濃度=A 值 × 稀釋倍數 × 50 μL/mL(1 個A 值相當于50 μL/mL 的DNA 或RNA)，換算為100 g 組織所含DNA 或RNA 的量。

(3)血漿E2、P、GH 和PRL 含量檢測

按照(1)中所取2.0 mL 血液加入0.5 mL 4.0%枸櫞酸鈉充分混勻，靜置15 min，4℃低溫離心(4000 r/min，15 min)，取血漿－20℃保存，按試劑盒說明書檢測血漿E2、P、GH、PRL 水平。

(4)乳房組織勻漿E2、P、GH 和PRL 含量檢測

取已冷凍的大鼠第3 對右側乳腺組織，冷生理鹽水漂洗除去血液，濾紙吸干水分，精密稱重，組織勻漿機中加入冷生理鹽水制成10 mg/mL 的組織勻漿，4℃，3000 r/min 離心15 min，取上清液，按試劑盒說明書檢測乳腺組織E2、P、GH、PRL 水平。

(5)E2和P 受體水平

取已冷凍的大鼠第3 對左側乳腺組織，采用放射配基結合分析法R(LBA)測定，參照文獻［11，12］，用Lowry 法測定樣本蛋白質濃度，胞質雌二醇和孕酮受體用加膜活性碳吸附法(DCC)測定，測定數據按Scatchard法作圖，求得雌二醇、孕酮受體的解離常數(Kd)和最大結合容量Bmax，受體數目以fmol/mg 胞質蛋白質表示。

(6)乳腺組織形態檢查

取大鼠近尾端第2 對左側乳房組織，迅速用10%的中性甲醛磷酸緩沖液固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察組織形態變化，計算每張切片中乳腺小葉的數目、乳腺小葉平均腺泡數及每張切片中3 個最大腺泡腔的直徑。

1.2.4 統計方法

2 結果

2.1 乳房性狀變化

對照組大鼠腹部近尾端第2、3 對乳頭體積較大，隆起較高，較堅實;實驗組大鼠乳頭體積較小，緊貼于皮膚，隆起較低，較松軟。與對照組比較，實驗組大鼠乳頭直徑和高度減小，乳房重量減輕，乳房系數減小，差異均有顯著性(P ＜0.05，P ＜0.01)，見表1、2。

2.2 乳房DNA、RNA 含量及RNA/DNA 比值

實驗組大鼠乳房組織DNA、RNA 以及RNA/DNA均明顯減小，與對照組比較，差異均有顯著性(P ＜0.05，P ＜0.01)，見表3。

2.3 血漿E2、P、GH 和PRL 含量

實驗組大鼠血漿E2、P、GH 和PRL 的含量均顯著降低，與對照組比較，差異均有顯著性(P ＜0.05)，見表4。

2.4 乳房組織勻漿E2、P、GH 和PRL 含量

與對照組比較，實驗組大鼠乳房組織勻漿E2和GH 的水平均顯著降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，實驗組大鼠血漿P 和PRL 水平具呈現下降趨勢，組間差異無顯著性，見表5。

2.5 E2 受體和P 受體水平

與對照組比較，實驗組大鼠乳房組織E2受體和P受體的Bmax 均明顯降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，E2受體和P 受體的Kd 均明顯增高(P ＜0.01)，見表6。

表1 孕鼠乳頭高度及直徑比較(±s，n=10，mm)Tab．1 Comparison of the diameter and height of rat breast nipples in different groups

表1 孕鼠乳頭高度及直徑比較(±s，n=10，mm)Tab．1 Comparison of the diameter and height of rat breast nipples in different groups

注:與對照組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。 Note. Compared with the control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

組別Groups乳頭高度Nipple height 乳頭直徑Nipple diameter第2 對Second pair第3 對Third pair第2 對Second pair第3 對Third pair對照組Control group 2.02±0.16 1.98±0.12 0.96±0.09 0.91±0.11實驗組Test group 1.85±0.11* 1.62±0.14＊＊ 0.75±0.12＊＊ 0.79±0.08*

表2 孕鼠乳房重量及乳房系數比較(±s，n=10，g)Tab．2 Comparison of the rat breast weight and index in different group

表2 孕鼠乳房重量及乳房系數比較(±s，n=10，g)Tab．2 Comparison of the rat breast weight and index in different group

注:與對照組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。 Note. Compared with the control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

組別Groups體重Body weight乳房重量Breast weight乳房系數Breast index對照組 Control group 273.82±21.12 4.43±0.21 16.18±2.16實驗組 Test group 260.15±16.14 3.47±0.32＊＊ 13.34±2.92*

表3 孕鼠乳房DNA 和RNA 水平比較(±s，n=10)Tab．3 Comparison of the rat breast DNA and RNA in different groups

表3 孕鼠乳房DNA 和RNA 水平比較(±s，n=10)Tab．3 Comparison of the rat breast DNA and RNA in different groups

注:與對照組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note. Compared with the control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

組別Groups DNA(mg/100 g tissue)RNA(mg/100 g tissue)RNA/DNA ratio對照組 Control group 32.52±4.36 63.40±13.66 1.95±0.18實驗組 Test group 27.19±5.61* 44.02±11.38＊＊ 1.62±0.26*

表4 孕鼠血漿E2、P、GH 和PRL 含量比較(±s，n=10)Tab．4 The level of E2，P，GH and PRL in the rat plasma in different groups

表4 孕鼠血漿E2、P、GH 和PRL 含量比較(±s，n=10)Tab．4 The level of E2，P，GH and PRL in the rat plasma in different groups

注:與對照組相比，* P ＜0.05。Note. Compared with the control group，* P ＜0.05.

組別 Groups E2/pg/mg P/ng/mg GH/ng/mg PRL/mU/g對照組 Control group 19.77±4.98 8.23±2.32 9.49±2.15 14.08±2.73實驗組 Test group 15.25±3.55* 6.04±1.26* 7.11±2.52* 11.85±3.03*

表5 孕鼠乳房組織E2、P、GH 和PRL 含量比較(±s，n=10)Tab．5 The levels of E2，P，GH and PRL in breast tissue homogenates in the rats of different groups

表5 孕鼠乳房組織E2、P、GH 和PRL 含量比較(±s，n=10)Tab．5 The levels of E2，P，GH and PRL in breast tissue homogenates in the rats of different groups

注:與對照組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。 Note. Compared with the control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

組別 Groups E2/pg/mg P/ng/mg GH/ng/mg PRL/mU/g對照組 Control group 7.43±2.46 3.63±0.94 16.28±3.23 8.12±2.64實驗組 Test group 5.40±1.28＊＊ 2.98±1.01 12.80±4.88*6.90±3.20

表6 孕鼠雌二醇和孕酮受體水平比較(±s，n=10)Tab．6 The levels of E2 or P receptors in the pregnant rats of different groups

表6 孕鼠雌二醇和孕酮受體水平比較(±s，n=10)Tab．6 The levels of E2 or P receptors in the pregnant rats of different groups

注:與對照組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。 Note. Compared with the control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

組別Groups E2 receptor P receptor Bmax(fmol/mg protein)Kd(×10－12，mol/L)Bmax(fmol/mg protein)Kd(×10－12，mol/L)對照組Control group 18.16±2.57 0.61±0.25 45.60±6.24 1.16±0.19實驗組Test group 15.20±3.68＊＊ 2.12±1.34＊＊ 38.29±5.52* 1.62±0.36＊＊

2.6 乳腺組織形態學變化

對照組大鼠乳腺呈小葉分布，小葉較大、數量較多;腺泡周圍及小葉間結締組織較少，血管豐富;可見到數量較多的乳腺導管與腺泡結構，導管較粗較長且分支均勻分布到整個乳腺區。腺泡呈圓形或橢圓形，大小不一，腺泡數量較多且體積較大，腺泡充盈且有大量分泌物，上皮細胞呈低立方柱狀，排列整齊，胞質空亮，可見圓形細胞核;實驗組大鼠乳腺脂肪和結締組織較多，乳腺小葉結構較少，導管和腺泡結構亦較少;導管較細較短且分支較少，腺泡數量較少，管腔萎縮甚至閉塞、上皮細胞扁平甚至消失，周圍反應性間質減少、致密。見圖1。實驗組乳腺小葉數目、乳腺小葉平均腺泡數、最大腺泡腔/小葉的直徑均低于對照組，差異均具有統計學意義(P ＜0.05，P ＜0.01)，見表7。

圖1 乳腺組織形態觀察(A.對照組;B.實驗組。H－E 染色)Fig．1 Mammary gland sections tissue in rats of normal control (A)and model (B)groups. H－E staining

表7 乳腺小葉數目、乳腺小葉平均腺泡數和腺泡直徑比較(±s，n=10)Tab．7 The number of lobules，gland acini and acinus diameter in the rats of different groups

表7 乳腺小葉數目、乳腺小葉平均腺泡數和腺泡直徑比較(±s，n=10)Tab．7 The number of lobules，gland acini and acinus diameter in the rats of different groups

注:與對照組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。 Note. Compared with the control group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

組別Groups乳腺小葉數目Lobule number乳腺小葉平均腺泡數Number of glandular cells腺泡直徑/μm Acinus diameter對照組Control group 55.23±6.30 61.23±11.36 509.48±141.25實驗組Test group 46.46±5.12＊＊ 48.43±7.74* 361.59±97.63*

3 討論

動物乳房發育受內分泌系統及神經系統的調控，并隨年齡、發情周期、生理狀態呈動態變化，且妊娠期是家畜乳腺主要的生長階段，到妊娠晚期或泌乳早期乳房才達到完全發育狀態［14，15］。本研究根據動物乳腺發育及其生理活動特點，選擇妊娠大鼠為研究對象，能短期集中反映乳腺發育的關鍵階段，雖哺乳期動物乳腺發育持續進行，但是其組織形態已基本穩定［13］。在動物乳腺發育過程中，除了營養因素外，環境不適引發心理應激是導致乳房發育不良的主要原因之一［2］。本研究根據家畜在飼養管理及運輸過程中存在的不良刺激因素，設計5 種刺激因素誘導心理應激的發生。根據養殖場外圍的噪聲污染，采用場景恐懼系統輸出噪音刺激，干擾大鼠生物反應;依據規模化集約式養殖的特點，設置束縛應激激發大鼠神經內分泌紊亂，影響其生長發育;模擬自然生存狀態，采用晝夜顛倒翻轉大鼠的生物節律，影響自然生存狀態;采用冰水游泳的方法實現冷應激刺激同時模擬強制驅趕，與束縛應激形成落差，導致大鼠體能、情志異常，出現抑郁甚至絕望;采用夾尾致痛的方法實現慢性疼痛和肢體不適帶來的影響;綜合以上5 種傷害性刺激，根據隨機、均衡的原則安排刺激因素，實現了不可預見性刺激反應，也體現了一定的交互作用或疊加作用，基本能真實反應環境異常導致的最常見心理應激，不足之處在于大鼠的孕期為19 ～22d，應激反應持續時間較短，如果選用孕期較長的動物可能會有新的發現。

本研究發現，心理應激影響大鼠的體重增長，可能與飼料的攝入不足或者胃腸功能紊亂有關，但差異在15 天內無統計學意義;孕鼠乳頭大小、乳房重量及系數的變化均能反映乳腺發育的大體性狀，研究結果顯示心理應激能阻礙乳房生長，預期對產后泌乳性能會帶來不良結果。前期研究表明大鼠乳腺重量和DNA、RNA 含量顯著提高能促進乳腺發育［10－14］，本研究發現應激刺激使孕鼠乳房重量、乳房組織DNA、RNA、RNA/DNA 水平均明顯降低，與前期研究結果相符。

心理應激主要通過下丘腦－垂體－腎上腺軸而影響神經－內分泌－免疫網絡，內分泌系統的紊亂是影響乳腺發育的重要原因［15－17］。E2能促進乳腺導管的發育、刺激上皮增生、導管及小葉周圍結締組織的發育，P 能促進腺小葉及腺泡的發育，GH 有利于導管和小葉腺泡生長，PRL 誘導腺小葉的分化，各種激素相互協同，調節乳腺發育［18－20］。E2、PRL 與GH 的協同作用可能是促進孕期乳房發育的重要因素。本研究中發現應激孕鼠乳腺組織PRL 水平具有下降的趨勢，但差異無統計學意義，可能與圍產期的不同時間有關。在受體方面，Kd是反映受體與配體結合的親和力的參數，Kd 值越小，表示激素與受體結合的親和力越大。應激孕鼠E2受體和P 受體的Kd 均顯著增高，說明E2和P 與其受體的的親和力降低，不利于E2和P 發揮正常的生理功能。本研究發現給予妊娠大鼠應激刺激后，其乳腺組織形態發生了明顯的變化，脂肪和結締組織增多，小葉數目以及腺泡與導管的數量、體積均減少，說明應激刺激后，乳房組織結構呈現出發育不良現象。

本研究結果為畜牧業生產中規避傷害性刺激導致心理應激影響孕畜乳腺正常發育而致缺乳提供了實驗依據，也為復制乳腺發育不良大鼠模型，開展促進乳腺發育、增強泌乳性能相關研究提供了方法參考。

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