高壓氧干預對大鼠脊髓繼發性損傷中HIF-1α及VEGF表達的影響

王 濤

(遼寧省沈陽市骨科醫院，遼寧 沈陽 110004)

高壓氧干預對大鼠脊髓繼發性損傷中HIF-1α及VEGF表達的影響

王 濤

(遼寧省沈陽市骨科醫院，遼寧 沈陽 110004)

目的 觀察大鼠脊髓損傷及高壓氧干預后不同時期受損脊髓組織內血管內皮生長因子(HIF-1α)及血管內皮生長因子(VEGF)表達的變化，探討高壓氧干預對大鼠急性脊髓損傷后的神經保護機制。方法 將成年SD大鼠80只采用改良Allen’s方法制作脊髓損傷模型，然后將大鼠隨機分為2組，損傷組不給予干預措施，干預組輔助以高壓氧干預。2組分別于損傷后1,3,7，14 d隨機抽取6只大鼠，采用BBB方法評價大鼠后肢運動功能，手術取出受損節段脊髓組織，采用熒光定量PCR法及Western-Blot法檢測HIF-1α及VEGF的表達情況。結果 2組大鼠損傷后均表現為雙下肢全癱，BBB評分0～1分；干預組損傷后7，14 d BBB評分明顯高于損傷組(P均<0.05)，損傷后3，7，14 d HIF-1α mRNA和蛋白的表達均明顯低于損傷組(P均<0.05)，術后7，14 d VEGF mRNA和蛋白的表達均顯著高于損傷組(P均<0.05)。結論 高壓氧干預能夠抑制HIF-1α的表達，且不依賴HIF-1α的作用實現VEGF的高表達，延長VEGF高表達的時間，從而發揮神經保護作用。

高壓氧；脊髓損傷；缺氧誘導因子-1α；血管內皮生長因子

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)是一種嚴重危害人類健康的傷病，具有很高的致殘率和致死率。高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)可以有效改善脊髓損傷后的肢體功能障礙，在多方面阻斷脊髓損傷后繼發的病理變化，是治療脊髓損傷的重要方法之一，其療效已經得到了研究證實[1-2]。然而，高壓氧對脊髓繼發損傷的神經保護作用機制并不明確。以往的實驗表明：脊髓損傷后導致局部缺氧缺血環境可以有效刺激缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達的增加，通過對血管內皮生長因子(VEGF)進行轉錄和轉錄后的調控，上調VEGF的表達，促進血管生成，改善微循環[3]。然而，這種脊髓組織對缺氧缺血環境的自我保護機制迅速而短暫，并不足以持續對抗脊髓繼發性的損傷。本研究通過比較HIF-1α及VEGF在脊髓損傷及高壓氧干預后不同時期表達的變化，探討高壓氧干預對大鼠急性脊髓損傷可能存在的神經保護作用機制。

1 實驗資料

1.1實驗動物與分組 成年健康SD大鼠80只，雌雄不限，8周齡，體質量250～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2012-0003。飼養環境：室內溫度18～26 ℃，相對濕度50%～75%。隨機平均分為損傷組及干預組。

1.2 動物模型的建立 2組均采用Allen’s重物墜落法(Weight-Dropping, WD)制作脊髓撞擊損傷模型[4-5]，撞擊成功標志：脊髓組織水腫、出血，硬脊膜完整膨隆呈紫紅色；大鼠出現擺尾反射，雙側下肢回縮撲動，遲緩性癱瘓。造模成功后大鼠靠前肢拖動身體，腹部貼地，雙后肢運動功能喪失，雙足背側著地，無負重功能，小便潴留，脊髓損傷大鼠運動功能評分系統(Basso,Beattie and Bresnassian locomotors rating scale，BBB)[5]評分0～1分。

1.3 高壓氧干預方法 干預組大鼠在造模后6 h置入動物高壓氧艙(YLC 0.5/0.8型)進行高壓氧干預：純氧洗艙5 min，升壓10 min，穩壓于2ATA，持續吸氧60 min，減壓15 min，干預時保持持續通風，氧流量維持8～10 L/min，艙內氧濃度在95%以上。前3 d每天2次，每次間隔8 h，3 d后每天1次。

1.4 大鼠后肢運動功能評價 各組大鼠損傷后1，3，7，14 d隨機抽取6只，由2名熟悉BBB評分標準的實驗人員進行盲法評分。

1.5 動物標本的取材 以0.3%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥位固定；腰背部原手術切口，剝離椎旁肌，暴露原打擊的T10硬脊膜區域，切除T8—9及T11—12棘突、椎板以及上下關節突關節，擴大脊髓暴露區域，保持硬脊膜完整，取出包括損傷節段的脊髓組織2.0～2.5 cm置于液氮保存。

1.6 HIF-1α mRNA及VEGF mRNA表達的檢測 采用免疫熒光定量PCR方法檢測。采用RNA抽提試劑盒(天根生物)提取脊髓組織總RNA；紫外分光光度計測定吸光度評價RNA純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。應用M-MLV逆轉錄酶(寶生物)合成cDNA。使用Bio Easy SYBR GreenⅠ實時定量PCR試劑盒(杭州博日)，結合SYBR Green熒光染料探測PCR產物，使用Line-gene熒光定量PCR檢測系統(杭州博日)測定擴增效率，評價溶解曲線，采用2-△△ct方法進行定量分析。

1.7 HIF-1α及VEGF蛋白表達的檢測 采用Western-Blot方法檢測。常規方法提取蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。電泳：配制12%分離膠和4%濃縮膠，每個樣品上量20 μg，電泳電壓分別為120 V分離膠和90 V濃縮膠。轉膜：PVDF膜先在甲醛溶液中浸濕，按順序組裝好轉膜裝置，電壓100 V，60 min，轉膜完畢后，TBST中洗1次，5 min。封閉：用TBST配制脫脂奶粉，將膜浸入，室溫4 h。一抗孵育：用1%封閉液將一抗HIF-1α，一抗VEGF和一抗B-actin分別按照1∶100，1∶200和1∶2 000比例稀釋，與膜共同孵育，4 ℃過夜后，TBST中洗3次，5 min/次。二抗孵育：用1%封閉液稀釋HRP標記的二抗(Jackson)山羊抗鼠和山羊抗兔，比例均為1∶10 000，與膜共同孵育4 h，TBST中洗3次，5 min/次。ECL曝光顯色，照相后使用LabWorks軟件對圖像進行灰度分析。

2 結 果

2.1造模情況 2組大鼠均表現為雙下肢全癱，完全符合大鼠脊髓損傷后肢行為學標準。

2.2 損傷后不同時間大鼠后肢運動功能BBB評分比較 損傷后1，3d，2組BBB評分比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。損傷后7，14d,干預組BBB評分均明顯高于損傷組(P均<0.05)。見表1。

表1 損傷后不同時間點后肢運動功能BBB評分比較

注：①與損傷組比較，P<0.05。

2.3HIF-1αmRNA及VEGFmRNA表達情況 損傷后1d， 2組HIF-1αmRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)；損傷后3，7，14d，干預組HIF-1αmRNA表達顯著低于損傷組(P均<0.05)。損傷后1，3d，2組VEGFmRNA表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；損傷后7，14d，干預組VEGFmRNA表達顯著高于損傷組(P均<0.05)。見表2及表3。

表2 損傷后不同時間點HIF-1α mRNA表達情況，分)

注：①與損傷組比較，P<0.05。

表3 損傷后不同時間點VEGF mRNA表達情況，分)

注：①與損傷組比較，P<0.05。

2.4HIF-1α及VEGF蛋白表達情況 損傷后1d，2組HIF-1α蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；損傷后3，7，14d，干預組HIF-1α蛋白表達顯著低于損傷組(P均<0.05)。損傷后1，3d，2組VEGF蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；損傷后7，14d，干預組VEGF蛋白表達顯著高于損傷組(P均<0.05)。見表4及表5。

表4 損傷后不同時間點HIF-1α蛋白表達情況，分)

注：①與損傷組比較，P<0.05。

表5 損傷后不同時間點VEGF蛋白表達情況，分)

注：①與損傷組比較，P<0.05。

3 討 論

HIF-1α作為體內氧調控信息傳遞通路中的低氧依賴性蛋白，受到細胞內氧分壓的精確調控，通過高表達激活目標基因的低氧反應元件，有效提高組織細胞對缺氧缺血環境的適應性。高壓氧干預可以有效改善脊髓損傷部位組織細胞的缺氧狀態，提高損傷周圍脊髓組織內的氧分壓，減輕低氧環境對HIF-1α表達增強的影響程度，增加泛素-蛋白酶系統對HIF-1α的降解作用[6-7]，從而導致HIF-1α表達的減少。本研究結果表明, 損傷后3，7,14d，干預組HIF-1αmRNA及HIF-1α蛋白表達均明顯低于損傷組(P均<0.05), 間接說明高壓氧的確能夠增加組織細胞的氧分壓，有效改善受損脊髓組織的缺氧狀態，這在脊髓損傷早期對減輕缺氧缺血所引發的繼發性損害具有積極意義。以往的研究發現[8-10]：HIF-1α表達的動態變化與細胞凋亡相關，提示HIF-1α對調節細胞凋亡起重要作用。

VEGF是上個世紀80年代發現的一種能夠特異性作用于血管內皮細胞的促血管生成因子。本研究結果表明，VEGF的表達變化趨勢與HIF-1α的表達變化趨勢不一致。相對于脊髓損傷后VEGF表達的增強，高壓氧干預后這種增強作用更加明顯，在損傷后的1，3d，干預組VGEF的表達有輕度增加，但差異無統計學意義；分析原因考慮為高壓氧抑制HIF-1α的表達，導致HIF-1α對VEGF的增強作用減弱有關。而在損傷后的7，14d，干預組VEGF的表達明顯增加(P<0.05)，表現為VEGF表達高峰的延遲以及高表達持續時間的延長。提示高壓氧能夠有效增加VEGF的表達，而且這一作用并不通過HIF-1α的增加來實現，考慮到VEGF的多個調控位點，推測高壓氧直接或間接通過其他的調控位點來發揮對VEGF的調控作用。有研究表明[11-13]：VEGF通過R2/flk-1受體途徑介導對脊髓神經細胞發揮神經營養作用。R2/flk-1受體不僅分布于血管內皮細胞，而且在神經元和神經膠質細胞中有廣泛表達。近年來研究顯示脊髓損傷后,R2/flk-1受體表達增加，VEGF通過該受體發揮促進血管生成及直接的神經營養與促進神經再生的作用[14]。本研究結果表明高壓氧能夠作為獨立因素增加VEGF的表達，通過這一途徑實現的高表達可能不僅僅是促進血管內皮細胞的增殖和再生來實現神經保護，還有可能是通過單獨的神經營養發揮作用。這與目前的一些研究認為VEGF作為一種獨立的神經保護因子發揮神經保護作用一致[10]。

綜上所述，高壓氧干預能夠有效改善脊髓損傷后的肢體功能障礙；通過抑制HIF-1α及增加VEGF的表達減輕神經組織損傷的程度，促進神經功能的恢復；高壓氧干預能夠作為獨立因素增加VEGF的表達，這一作用不依賴HIF-1α的調控作用，VEGF的高表達可能不僅僅是促進血管內皮細胞的增殖和再生來實現神經保護，更可能是通過單獨的神經營養發揮神經保護作用。

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Effect of hyperbaric oxygen intervention on HIF-1 alpha and VEGF expression in rats with spinal cord secondary injury

WANG Tao

(Orthopedic hospital of Shenyang, Shenyang 110004, Liaoning, China)

Objective It is to observe the changes of hypoxia inducing factor-1 alpha (HIF-1 alpha) and VEGF expression in the injuried spinal cord tissue in the rats with spinal cord injury (SCI) before intervention and in different periods after intervention with hyperbaric oxygen, to explore the nerve protective mechanism of hyperbaric oxygen for acute SCI. Methods 80 adult SD rats used to establish SCI models by modified Allen’s method, then the models were randomly divided into two groups, the injury group were given no intervention, while the intervention group was treated with hyperbaric oxygen after model establishing. Six rats were randomly selected from each group in 1, 3, 7, 14 days after injury to evaluate hind limbs motor function by BBB method, and their damaged spinal cord segments were taken out by surgery to detect the expression of HIF - 1 alpha and VEGF by fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) and Western Blot method. Results All the rats in both group were characterized by double lower limbs panplegia, BBB score of 0～1 after injury; the BBB scores in intervention group were significantly higher than that in the injury group in 7, 14 days after injury (allP<0.05); the expression of HIF-1alpha mRNA and protein in intervention group were significantly lower than that in the injury group in 3, 7, 14 days after injury (allP<0.05), the expression of VEGF mRNA and protein in intervention group were significantly higher than that in the injury group in 7, 14 days after injury (allP<0.05). Conclusion Hyperbaric oxygen intervention can inhibit the expression of HIF-1 alpha, and do not rely on HIF-1 alpha role to realize high expression of VEGF, extend the time of high expression of VEGF, thus to play nerve protective effect.

hyperbaric oxygen; spinal cord injury; hypoxia inducing factor-1 alpha; vascular endothelial growth factor

王濤，男，主治醫師，研究方向為創傷骨科。

遼寧省教育廳科學研究項目(L2010550)；沈陽醫學院科學研究基金項目(20121019)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.22.003

R-332

A

1008-8849(2015)22-2403-03

2015-01-10