骨髓源性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及分化為內(nèi)皮細(xì)胞的研究

胡 洋，郝蘭坡，趙炳飛，趙夢華

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

骨髓源性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)及分化為內(nèi)皮細(xì)胞的研究

胡 洋，郝蘭坡，趙炳飛，趙夢華

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

目的 探討骨髓源性血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)在體外分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定的方法。方法 抽取SD大鼠的骨髓細(xì)胞，離心法提取骨髓液中單個核細(xì)胞，用含有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)的培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs，觀察并記錄EPCs的生長分化過程；對培養(yǎng)后的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物，同時，RT-PCR法檢測EPCs特異性分子標(biāo)志物。結(jié)果 培養(yǎng) 24 h后細(xì)胞開始貼壁，4 d后細(xì)胞呈集落樣生長，細(xì)胞從集落中央向外周生長，至培養(yǎng)的第7天成片生長的細(xì)胞集落相互連接，10 d 后細(xì)胞形態(tài)明顯改變，呈現(xiàn)典型的“鵝卵石樣”外觀。貼壁細(xì)胞免疫熒光檢測顯示CD34、CD133、VEGFR-2、FGFR1均陽性，經(jīng)RT-PCR法檢測，EPCs表達(dá)的特異性分子標(biāo)志物均為陽性。結(jié)論 以梯度離心法獲得骨髓單個核細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后，可擴(kuò)增出具有典型特征的EPCs，呈貼壁增殖狀態(tài)且具有分化能力，經(jīng)體外誘導(dǎo)可分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞。

骨髓；內(nèi)皮祖細(xì)胞；細(xì)胞分離；誘導(dǎo)；血管內(nèi)皮細(xì)胞

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是具有增殖、擴(kuò)增并分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的一類多潛能細(xì)胞。近年來，EPCs在血管內(nèi)皮功能受損和缺血梗阻性疾病中的治療作用受到越來越多專家學(xué)者的重視，其相關(guān)的基礎(chǔ)研究亦受到廣泛關(guān)注。目前EPCs主要從骨髓、臍帶血及外周血中獲取[1-3]。外周血來源的EPCs損傷相對小、取材相對容易而被普遍使用，但此方法所獲取到的EPCs純度較低。骨髓中含有大量的祖細(xì)胞，與外周血和臍帶血相比，骨髓液所含的血管EPCs更加豐富，故本實驗擬從大鼠的骨髓液中分離、提取、培養(yǎng)EPCs，以期探索出一種能達(dá)到穩(wěn)定生成及擴(kuò)增的EPCs分離培養(yǎng)方法，并通過細(xì)胞因子對EPCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，使之分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，為將來治療臨床血管損傷性疾病或缺血性疾病提供細(xì)胞來源和理論基礎(chǔ)。

1 實驗資料

1.1 實驗動物 成年SD大鼠，體質(zhì)量，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗基地提供，動物合格證號：SCXK-2013-0005。

1.2 主要試劑和儀器 LD5-10B水平離心機(jī)(美國Sigma公司)，IX71-F22DIC倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，熒光顯微鏡(德國Leica公司)，細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)，CO2培養(yǎng)箱(德國binder公司)，CM-3600D分光光度儀(日本美能達(dá))，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海實貝儀器設(shè)備有限公司)，DL-CJ-2N超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，高速離心機(jī)(日本日立公司)，血細(xì)胞計數(shù)板(德國Brand)，全自動電熱壓力蒸汽滅菌器(tommy 公司)，超純水凈化系統(tǒng)(美國Pall公司)，PCR儀(美國Sigma公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Sigma公司)，電泳儀(日本Olympus公司)。

1.3 試劑配制 ①PBS：分別稱取8.0 g NaCl，2.9 g Na2HPO4·12H2O，0.2 g KCl和0.2 g KH2PO4，加1 000 mL超純?nèi)羲?21℃高壓蒸汽滅菌后，常溫保存?zhèn)溆谩＂?.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA2Na ：稱取0.25 g胰蛋白酶，100 mL PBS溶解0.02 g EDTA2Na，吹打?qū)⑵渫耆芙猓?.22 μm微孔濾器過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩＂燮咸烟?泛影葡胺(Percoll)工作液配置：Percoll原液經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，按9份Percoll原液與1份10倍濃縮的PBS的比例加入濃縮的PBS混勻制成儲存液，按照60%的儲存液與40%的正常的無鈣鎂PBS混勻后配成終濃度為1.077 g/mL的工作液4 ℃避光保存。④4%多聚甲醛：稱取4 g多聚甲醛，加入100 mL 超純水中，60 ℃水浴過夜溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩＂軱-谷氨酰胺：將2.923 g谷氨酰胺溶解于100 mL PBS中，0.22 μm微孔濾器過濾除菌并分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＂薅嗑圪嚢彼崛芤号渲疲憾嗑圪嚢彼? mg溶于50 mL硼酸緩沖液中，配成濃度為100 μg/mL的多聚賴氨酸溶液。⑦4%牛血清白蛋白(BSA)：稱取4 g BSA加入100 mL PBS中，混勻備用。⑧0.1%明膠配制：稱取0.1 g明膠，加入100 mL PBS中，高壓蒸汽滅菌后，4 ℃保存?zhèn)溆谩＂峒?xì)胞培養(yǎng)皿/板的預(yù)處理：將配制好的0.1%的明膠在無菌條件下平鋪于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板的表面，放入培養(yǎng)箱平衡4～6 h，用吸頭吸出液體后，即可接入細(xì)胞。⑩細(xì)胞爬片的預(yù)處理：將蓋玻片放置于無菌盒子中，經(jīng)過高壓蒸汽滅菌器，滅菌處理放入烘干箱烘烤干燥并冷卻后置于超凈工作臺中用多聚賴氨酸進(jìn)行包被載玻片，輕輕移入培養(yǎng)板內(nèi)放置于培養(yǎng)箱內(nèi)過夜包被后，次日吸取多聚賴氨酸后即可接種細(xì)胞。表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的分裝：取50 μg細(xì)胞因子粉末，加入50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中充分溶解過濾、標(biāo)注后分裝，-20 ℃密封凍存。DMEM /F12+2 mmol/L谷氨酰胺+10 ng/mL bFGF+10 ng/mL IGF-1+10 ng/mL EGF+10% FBS。EPC細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化誘導(dǎo)液：DMEM/F12+2 mmol/L-谷氨酰胺+10 ng/mL bFGF+10 ng/mL IGF-1+50 ng/mL EGF+10% FBS。0.1%臺盼藍(lán)溶液：稱取0.1 g臺盼藍(lán)粉末，加入100 mL PBS中，充分?jǐn)嚢枞芙夂髠溆谩?/p>

1.4 EPCs的分離 成年SD大鼠脫頸處死，用新潔爾滅溶液消毒后取大腿骨在無菌操作臺內(nèi)剝離肌肉及結(jié)締組織，取脛骨，切除干骺端，暴露骨髓腔。使用注射器抽吸骨髓于無血清培養(yǎng)基，用針頭輕輕吹打成細(xì)胞懸液，800 g離心15 min。棄去上層雜質(zhì)，將下層細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基清洗2～3次，重懸細(xì)胞。取10 mL離心管，緩慢注入1.077 g/mL的Percoll分離液3 mL，再緩慢注入已制備好的骨髓單細(xì)胞懸液3 mL。放入離心機(jī)，待離心結(jié)束后收集白膜層的單個核細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗滌2次。細(xì)胞計數(shù)后以 2×107/cm2密度加入鋪有0.1%明膠的6孔板， 37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每3 d換液1次。

1.5 EPCs生長曲線的繪制 取生長良好的第2、第5、第8代細(xì)胞，分別接種于 24 孔板，每天取 3 孔消化后計數(shù)(每孔計數(shù) 3 次，計算均值)，以培養(yǎng)時間作為橫軸，細(xì)胞計數(shù)作為縱軸，描繪細(xì)胞生長曲線。

1.6 間接免疫熒光法檢測EPCs表面抗原 將細(xì)胞制成懸液接種于前述處理好的載玻片上，無菌培養(yǎng)后，用 4%多聚甲醛滴加在載玻片上固定細(xì)胞15 min。參照各抗體說明進(jìn)行CD34、CD133、VEDFR-2免疫熒光檢測；0.025% TritonX-100室溫下通透處理細(xì)胞膜15 min，PBS漂洗2～3次，每次3～5 min。用PBS稀釋后的一抗(CD34、CD133、VEDFR-2)滴加到細(xì)胞爬片上，將細(xì)胞爬片置于冰箱內(nèi)，4 ℃孵育過夜；用PBS漂洗細(xì)胞爬片2～3次，每次3～5 min，以洗去與細(xì)胞非特異性結(jié)合的抗體；將FITC標(biāo)記的二抗用PBS稀釋后滴加到細(xì)胞爬片上，37 ℃條件下避光孵育1 h； PBS漂洗2～3次，每次3～5 min；將hoechst 33258稀釋后滴加到細(xì)胞爬片上，復(fù)染細(xì)胞核15 min； PBS漂洗2～3次，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 EPCs表面標(biāo)志物的RT-PCR檢測 ①當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80% 時，吸除培養(yǎng)基后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2～3次。②Trizol法提取細(xì)胞總RNA:吹打細(xì)胞懸液后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，室溫下靜置，充分裂解細(xì)胞。向離心管中加入0.2 mL氯仿，顛倒震蕩15 s，室溫靜置3 min。把離心管置于高速離心機(jī)中，4 ℃，12 000 r/min，離心12 min。離心后將含有RNA的水相層轉(zhuǎn)移至另一個離心管中，加入0.5 mL異丙醇沉淀RNA，混勻后于室溫下靜置10 min。再次低溫高速離心10 min，去上清，以75% 乙醇洗滌沉淀2次。再次離心后棄去上清，室溫下晾干，紫外分光光度計測定260 nm和280 nm下的OD值。③cDNA的合成：提取的總RNA用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver. 3.0 反轉(zhuǎn)錄合成并擴(kuò)增cDNA。④按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min共1個循環(huán)。⑤特異性引物設(shè)計：在Genbank查詢基因信息，Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行特異性引物的設(shè)計。⑥PCR檢測：將5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL上樣緩沖液混勻后進(jìn)行2% 瓊脂糖凝膠電泳。用凝膠成像系統(tǒng)檢測目的基因的表達(dá)情況并拍照。

1.8 EPCs向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化及檢測 將生長良好的細(xì)胞接種到24孔板中，棄去培養(yǎng)基，用 PBS 洗細(xì)胞3次，加入內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)液，每隔2 d換液1次，誘導(dǎo)至10 d，對細(xì)胞進(jìn)行CD144、CD31免疫熒光檢測，方法同上。設(shè)置對照組：加常規(guī)EPCs培養(yǎng)液，每隔2～3 d換液1次。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué) 分離出的骨髓單個核細(xì)胞呈圓形，大小不等，培養(yǎng)24～48 h后部分細(xì)胞貼壁、增大，形狀變?yōu)樗笮?見圖1。培養(yǎng)8 d，有大量梭形貼壁細(xì)胞并連接成條索樣，細(xì)胞集落出現(xiàn)；7～10 d出現(xiàn)多個細(xì)胞團(tuán)，邊緣細(xì)胞出芽長出，呈單層生長，此結(jié)構(gòu)類似于血島，亦可見細(xì)胞線狀排列。培養(yǎng)至14 d時，細(xì)胞融合，呈大片的條索狀結(jié)構(gòu)，見圖2。

圖1 新分離的EPCs 形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

圖2 培養(yǎng)14 d EPCs形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2.2 EPCs生長曲線 第2、第5、第8代EPCs的生長增殖情況類似，保持了良好的生長趨勢。見圖3。

圖3 第2、第5、第8代EPCs生長曲線

2.3 EPCs免疫熒光檢測結(jié)果 EPCs表面標(biāo)志物CD34、CD133、VEGFR-2、FGFR1均呈陽性，陽性率分別為(56.23±0.18)%、(87.23±1.66)%、(90.64±0.87)%、(89.78±0.99)%，免疫熒光表現(xiàn)見圖4～7。

2.4 RT-PCR鑒定結(jié)果 分離培養(yǎng)的EPCs CD34、CD133、VEGFR2、FGFR1能用RT-PCR方法檢測到條帶，進(jìn)一步說明分離的細(xì)胞為EPCs。見圖8。

2.5 誘導(dǎo)分化鑒定 EPCs在內(nèi)皮誘導(dǎo)液誘導(dǎo)10 d后，細(xì)胞形態(tài)明顯改變，由原來的梭形逐漸縮短、變圓，最后變?yōu)槊黠@的“鵝卵石樣”結(jié)構(gòu)。免疫熒光檢測后CD144、CD31陽性。

圖4 CD34表達(dá)情況

圖5 CD133表達(dá)情況

圖6 VEGFR-2表達(dá)情況

圖7 FGFR1表達(dá)情況

圖8 CD34、CD133、VEGFR-2和FGFR-1陽性表達(dá)情況

3 討 論

3.1 EPCs的來源 目前，國內(nèi)專家和學(xué)者一致認(rèn)為，EPCs主要存在于臍帶血、胎肝、胎脾、外周血及骨髓當(dāng)中，其中骨髓是最主要的來源[3-4]。以往國內(nèi)體外培養(yǎng)EPCs主要來源于外周血，因為外周血來源的EPCs損傷相對小、取材相對容易而被廣泛使用，但此方法所獲取到的EPCs純度較低；而臍帶血取材往往需征得產(chǎn)婦及家屬的知情同意，手續(xù)相對繁瑣，且涉及倫理問題。目前，作為EPCs最主要來源的骨髓組織，因含有極其豐富的干細(xì)胞和祖細(xì)胞，在取材上較外周血和臍帶血更具有優(yōu)勢[1]。骨髓細(xì)胞比較容易獲取并通過成熟的培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行體外擴(kuò)增，且干細(xì)胞或祖細(xì)胞屬于自體來源，用于移植治療后無免疫排斥反應(yīng)。因此，本實驗采用骨髓細(xì)胞作為EPCs的來源。

3.2 EPCs的分離、培養(yǎng) 目前，體外培養(yǎng)EPCs的方法主要有流式細(xì)胞儀、免疫磁珠法和密度離心法[5]。流式細(xì)胞儀是干細(xì)胞分離和鑒定的重要方法，它可以精確分析樣本中細(xì)胞的表型和數(shù)量，通過分選方法以極高的純度將目標(biāo)細(xì)胞群分離出來；但缺點(diǎn)是分選的速度相對較慢，細(xì)胞數(shù)量小，花費(fèi)比較昂貴。免疫磁珠分選法是僅次于流式細(xì)胞儀的分離高純度細(xì)胞的另一種實驗方法，能夠分選出足夠數(shù)量的目標(biāo)細(xì)胞，但只能針對一種細(xì)胞表型，對表達(dá)多種細(xì)胞表型的細(xì)胞群不適用。通常采用CD34單抗CD133單抗的免疫磁珠來吸附和分選，純度較高，但實驗花費(fèi)也較高，為動物實驗和臨床實驗增加了很大經(jīng)費(fèi)支出[6]。已有研究證實，利用免疫磁珠分選法分離獲得的CD34+和CD133+細(xì)胞很少，且單獨(dú)培養(yǎng)不易增殖，只有同CD34-或成熟內(nèi)皮細(xì)胞一起培養(yǎng)才有增殖活性[5]。

密度離心法分離細(xì)胞是目前最常用的實驗方法。采用此方法可從骨髓血中直接獲取單個核細(xì)胞，之后用細(xì)胞貼壁篩選法來分離EPCs，培養(yǎng)擴(kuò)增則在培養(yǎng)基中添加了VEGF、 EGF、bFGF等促內(nèi)皮細(xì)胞生長因子。密度梯度離心法具有操作簡單的優(yōu)點(diǎn)，但往往分離不純。CD133+KDR+雙熒光細(xì)胞分選法可得到較高純度的EPCs，但分選技術(shù)難度較大，費(fèi)用高昂。在本研究中，筆者將分離的EPCs以 (1～4)×107/cm2的密度接種在纖維連接素包被的培養(yǎng)板上，用含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，同時加入FGF2、VEF、EGF和IGF進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后PBS液洗去非貼壁細(xì)胞，之后繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d，貼壁的梭形細(xì)胞可用少量胰蛋白酶消化收集。此方法較好地兼顧了細(xì)胞分離純度和經(jīng)濟(jì)支出兩方面問題。

在密度離心法分離培養(yǎng)細(xì)胞過程中，常規(guī)同時應(yīng)用多種細(xì)胞生長因子促進(jìn)細(xì)胞的生長分化。 EPCs 具有很嚴(yán)格的培養(yǎng)液要求，必須采用特殊配方培養(yǎng)液。最常用的EPCs培養(yǎng)液是EGM-2，少數(shù)情況下可用RPMI1640、IMDM、長周期培養(yǎng)液、Medium199和條件培養(yǎng)液。無論選用哪種培養(yǎng)液，在刺激因子的作用下都能誘導(dǎo)分化出典型的內(nèi)皮細(xì)胞。培養(yǎng)過程中除需要bFGF、VEGF等多種刺激因子存在外，還需要許多未知因子的參與。當(dāng)黏附的細(xì)胞數(shù)較少時，可在培養(yǎng)液中加入單核細(xì)胞，這有促進(jìn)黏附細(xì)胞生長的作用，其原理是細(xì)胞之間通過接觸傳遞了某種信號或分泌了某些末知因子。在培養(yǎng)液中添加牛腦提取物、胎牛血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)就是考慮到一些末知生長因子存在的可能[7]。

3.3 EPCs的增殖 正常情況下，EPCs的獲取量較少，外周血每毫升中僅含有2～3個，臍帶血含量比外周血高3.5倍[2]。成熟的內(nèi)皮細(xì)胞可在培養(yǎng)基中迅速進(jìn)入增殖期，但4～6周后增殖活力卻逐步下降，而骨髓來源的EPCs在培養(yǎng)15～20 d后可迅速形成內(nèi)皮細(xì)胞層，呈“鵝卵石”樣形態(tài)，并能穩(wěn)定的傳代30次以上，增殖潛能10倍于臍靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞。從骨髓中分離的單個核細(xì)胞，在VEGF的作用下可擴(kuò)增約1 000倍，并能表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞所具有的特異性抗原[7]。

3.4 EPCs的誘導(dǎo)分化 EPCs以前一直被認(rèn)為是單能干細(xì)胞，只能分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，不過這種觀點(diǎn)現(xiàn)在正發(fā)生著變化。隨著培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)液的改變，EPCs有向其他細(xì)胞分化的潛能。EPCs需借助細(xì)胞培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子的作用才能分化。促使EPCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的因子很多，vEGF是其中作用最強(qiáng)一種。EPCs首先通過細(xì)胞膜上的VEGFR-2受體和激動蛋白激酶B，再通過IP3通路激活各種細(xì)胞內(nèi)信號，從而啟動細(xì)胞的生長分化[6]。另外，促使EPCs向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化的不可或缺的因子有EGF、bFGF及IGF等。

培養(yǎng)基中細(xì)胞因子組成成分的差異會影響骨髓中單個核細(xì)胞的生長和分化。在本研究中，應(yīng)用細(xì)胞因子VEGF和bFGF作為EPCs的誘導(dǎo)分化劑，成功將其誘導(dǎo)為血管內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF是一種高選擇度的促內(nèi)皮細(xì)胞分裂素，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生；在體外培養(yǎng)中，VEGF濃度和EPCs的生長率呈正相關(guān)，而bFGF和VEGF之間存在協(xié)同作用關(guān)系，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和移行，進(jìn)而增生出毛細(xì)血管樣的組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)新生血管的產(chǎn)生[7-8]。單個核細(xì)胞在兩者的聯(lián)合作用下可向內(nèi)皮細(xì)胞生長和分化，從而說明這是一種可行的促進(jìn)EPCs增殖并分化的實驗方法。

3.5 EPCs的鑒定 EPCs的表面標(biāo)志物是指細(xì)胞表面獨(dú)有的特異性生物大分子，主要是蛋白質(zhì)，借此可以區(qū)分不同種類的細(xì)胞。CD133是EPCs的表面標(biāo)志物，它在向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中逐漸丟失，此種鑒定方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠區(qū)分出前體細(xì)胞；但CD133亦可選擇性的表達(dá)于早期造血干細(xì)胞、骨髓及外周血的祖細(xì)胞，所以不能單純通過它來鑒定EPCs和造血細(xì)胞。CD34抗原作為一種糖蛋白可表達(dá)于細(xì)胞表面，隨著幼稚細(xì)胞的分化逐漸成熟，其表達(dá)水平卻趨于下降，是EPCs的重要標(biāo)志物[6-7]。本實驗對所獲得的培養(yǎng)10 d的EPCs 進(jìn)行表面標(biāo)志物檢測發(fā)現(xiàn)，CD34、CD133、VEGFR-2、FGFR1均呈陽性，RT-PCR鑒定亦獲得了基本相同的結(jié)果，說明本研究分離、培養(yǎng)所形成的細(xì)胞為EPCs。

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Study on the separation and culture in vitro of bone marrow derived endothelial progenitor cells and its differentiation into endothelial progenitor

HU Yang, HAO Lanpo, ZHAO Bingfei, ZHAO Menghua

(Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei, China)

Objective It is to explore the method for the the separation and culture in vitro and identification of bone marrow derived endothelial progenitor cells (EPCs). Methods The bone marrow cell of SD rats were selected and the mononuclear cells were extracted by centrifugation method, the cells were cultured by culture solution which containing VEGF, bFGF, EGF to induce EPCs, the growth and differentiation process were observed. The cultured cells were stained by immunofluorescence staining to identify the surface markers, and the specific molecular markers were identified by RT-PCR method. Results After culture for 24 h, the cell attachment was found; in 4 days later, the cells showed colony growth, and growth was from the center to the peripheral region; in 7 days later, the colony growth were more obvious like flakiness and connected with each other; in 10 days later, the changes of cell morphology structure was obvious, which showed a typical appearance like cobblestone. Immunofluorescence detection showed that CD34, CD133, VEGFR-2, FGFR1 were all positive, RT-PCR method showed that specific molecular markers of EPCs were positive. Conclusion Spinal cord mononuclear cells gotten by gradient centrifugation can be cultured to amplify EPCs with typical characteristic which show adherence proliferation status with differentiation ability to became grown-up blood endothelial cells by induction in intro.

bone marrow; endothelial progenitor cells; separation; induction; blood endothelial cells

胡洋，男，主治醫(yī)師，主要從事心血管基礎(chǔ)疾病的相關(guān)研究。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.22.008

R-33

A

1008-8849(2015)22-2421-05

2015-01-12