褐藻糖膠對多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226中Wnt/β-catenin通路的影響研究

李 燕,李 靜,閻桂艷,羅建民,郝洪嶺,王素云,李 杰,楊 潔,袁 軍,王瑞倉,張培軍

(1. 河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050000；2. 河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011；3. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000；4. 河北省高碑店市醫(yī)院，河北 高碑店 074000)

褐藻糖膠對多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226中Wnt/β-catenin通路的影響研究

李 燕1,李 靜2,閻桂艷1,羅建民3,郝洪嶺1,王素云1,李 杰1,楊 潔1,袁 軍1,王瑞倉1,張培軍4

(1. 河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050000；2. 河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011；3. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000；4. 河北省高碑店市醫(yī)院，河北 高碑店 074000)

目的 探討褐藻糖膠誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226凋亡過程中Wnt/β-catenin通路的變化。方法 應(yīng)用褐藻糖膠誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPM18226的凋亡，觀察多發(fā)性骨髓瘤細胞株經(jīng)10，25，50，100 μg/mL濃度褐藻糖膠分別作用24，48，72 h后細胞增殖抑制率。將細胞分為3組：空白組不予藥物干預(yù)，褐藻糖膠組給予25 μg/mL褐藻糖膠培養(yǎng)，Wnt通道抑制劑(DKK-1)組給予DKK-1培養(yǎng)。用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測3組RPMI822細胞凋亡率，通過Western blot方法檢測3組β-catenin與c-myc蛋白表達情況。結(jié)果 隨褐藻糖膠濃度的增高和作用時間的延長，細胞增殖抑制率明顯增高(P均<0.05)。褐藻糖膠組細胞凋亡率明顯高于空白組；褐藻糖膠組和DKK-1組β-catenin 和 c-myc 蛋白表達水平均明顯低于空白組(P均<0.05)，褐藻糖膠組與 DKK-1組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論褐藻糖膠能夠誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226發(fā)生凋亡，與DKK-1作用相當(dāng)，并且褐藻糖膠能夠有效抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞株中Wnt/β-catenin通路的活化狀態(tài)，為有效治療多發(fā)性骨髓瘤患者提供了理論依據(jù)。

褐藻糖膠；多發(fā)性骨髓瘤細胞RPMI8226；Wnt/β-catenin通路；β-catenin

多發(fā)性骨髓瘤是一種來源于終末分化的B淋巴細胞的惡性血液病，其特點為漿細胞異常增生，可引起骨質(zhì)、腎臟等靶器官的損害，從傳統(tǒng)的化療到聯(lián)合造血干細胞移植，緩解率雖然取得了一定的成效，但復(fù)發(fā)率仍較高，臨床治療效果仍然不理想，從而需要積極尋找有效的治療方法。目前有研究證實了多發(fā)性骨髓瘤細胞系及多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中高表達 β-catenin, 且在體外證實了 Wnt/β-catenin 信號通路有調(diào)節(jié)多發(fā)性骨髓瘤細胞增殖和侵襲的作用[1]。Wnt/β-catenin通路是始終在生物進化中保持高度保守的信號通路，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展往往與此通路密切相關(guān)。褐藻糖膠是一種天然的復(fù)合多糖，其分子鏈末端含有天然的硫酸基。近年研究發(fā)現(xiàn)褐藻糖膠具有抗凝血、 抗動脈硬化、 抗輻射、 抗腫瘤、 抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，其可以誘導(dǎo)癌細胞凋亡，可用作癌細胞凋亡誘導(dǎo)劑[2]。Yasui等[3]研究發(fā)現(xiàn)，褐藻糖膠能夠起到誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞株凋亡、抑制增殖等作用。但目前有關(guān)褐藻糖膠對Wnt/β-catenin通路的影響研究較少。本研究通過觀察褐藻糖膠誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226凋亡情況及對Wnt/β-catenin通路的相關(guān)靶基因c-myc的影響，探討了褐藻糖膠誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡的機制，現(xiàn)報道如下。

1 實驗資料

1.1 材料與試劑 人多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液病研究所長期保存細胞系)， 99%的褐藻糖膠、MTT檢測試劑(美國Sigma公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，V-FITC/PI凋亡試劑盒以及蛋白提取劑(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，β-catenin兔抗人抗體(美國Santa cruz公司)，電子天平(德國Sartorius)，超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)，CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，β-actin鼠抗人抗體(美國Santa cruz公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠和鼠抗兔二抗(北京中山公司)，微型高速離心機(德國Eppondoff公司)，-80 ℃的冰箱(日本SANYO公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，DKK-1wnt通路抑制劑(北京中山公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞增殖抑制率的檢測 人多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清、100 IU/mL青霉素及100 μg/mL硫酸鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，每3 d換液傳代1次。細胞經(jīng)傳代4次后，取對數(shù)生長期的RPMI8226細胞株，以1×109L-1接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。每孔加入終濃度分別為10，25，50，100 μg/mL的褐藻糖膠溶液10 μL，每組3個復(fù)孔，在37 ℃、5%CO2條件下孵育24，48，72 h后，每孔中加入2 mg/mL MTT，在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄上清，每孔中再加入10% DMSO 150 μL 終止反應(yīng),待結(jié)晶完全溶解后用酶聯(lián)免疫檢測儀于570 nm測定各孔吸光度OD值。細胞生長抑制率=(1-實驗組OD)/對照組OD×100%。

1.2.2 細胞凋亡率的檢測 用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況。取對數(shù)生長期的RPMI8226細胞株，制成0.5×109L-1單個細胞懸液。將細胞分為3組：空白組不予干預(yù)，褐藻糖膠組以25 μg/mL的褐藻糖膠培養(yǎng)，DKK-1組以DKK-1培養(yǎng)。在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h，收集細胞液，離心3 min，拋棄培養(yǎng)基，使用PBS溶液清洗3次，將細胞放置于500 μL的混懸液中，加入5 μL的PI溶液以及Annexin V/FITC溶液，吹打均勻后，冰上、避光條件下反應(yīng)10 min，于1 h內(nèi)送流式細胞儀檢測，所有實驗均需要重復(fù)3次。

1.2.3 β-catenin與c-myc蛋白的測定 取對數(shù)生長期的RPMI8226細胞株，制成0.5×109L-1單個細胞懸液，接種于5 mL培養(yǎng)瓶中。將細胞分為空白組、 DKK-1組(終濃度為100 ng/mL)及褐藻糖膠組(終濃度為25 μg/mL，1/2 IC50值)，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h后， 收集對數(shù)生長期細胞，168 g離心3 min，PBS洗滌3次； 按照細胞總蛋白提取試劑盒說明書提取細胞蛋白，BCA法進行蛋白定量測定。 每組取30 μg蛋白質(zhì)樣本進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，TBST稀釋一抗β-catenin(1∶200)、c-myc(1∶200)。膜與一抗4 ℃孵育過夜， TBST洗膜3次， 孵二抗(均為1∶4 000)， 二抗室溫下孵育1.5 h， TBST洗膜3次， ECL顯色， 定影， 實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用2檢驗，并以率(%)表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞增殖抑制情況 褐藻糖膠對于多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)出時間-劑量的變化，隨濃度的增高和作用時間的延長，細胞增殖抑制率明顯增高(P均<0.05)。作用72 h各濃度間的抑制率均高于24 h、48 h(P均<0.05)。見表1。

表1 細胞增殖抑制情況

注：①與72 h比較，P<0.05。

2.2 細胞凋亡情況 褐藻糖膠組凋亡率為15.28%，空白組為6.28%，DKK-1組為13.35%。褐灌糖膠組和DKK-1組凋亡率均明顯高于空白組(P均<0.05)。

2.3 β-catenin與c-myc蛋白水平比較 作用72 h后，褐藻糖膠組和DKK-1組β-catenin和c-myc蛋白表達水平均明顯低于空白組(P均<0.05)，褐藻糖膠組與DKK-1組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 3組β-catenin與c-myc蛋白水平比較

注：①與空白組比較，P<0.05。

3 討 論

褐藻糖膠是從海帶中提取和純化的多糖類制劑，由巖藻糖和硫酸基組成，主要分子結(jié)構(gòu)為 α-L-巖藻糖-4-硫酸酯。褐藻糖膠可通過多條信號通路誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，但對不同的腫瘤細胞作用機制有所不同[4]。褐藻糖膠能夠顯著抑制細胞外基質(zhì)降解酶對于內(nèi)皮下細胞外基質(zhì)的降解作用，從而抑制腫瘤細胞的遠處遷移[5]。

Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用，它是Wnt信號通路傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑。其中β-catenin是Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵作用分子,它的過度表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系緊密，其通過特有的方式能夠讓一種重要的信號分子參與到細胞異常增殖的過程中，從而導(dǎo)致患者腫瘤的形成[6]。β-catenin同時也是一種原癌基因，其有較多種功能的細胞骨架蛋白，能夠與E-鈣黏蛋白相互作用，從而使同種類型的細胞進行黏附，并且在患者腫瘤轉(zhuǎn)移以及對患者進行侵襲的過程中起重要作用。另外β-catenin是Wnt經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的重要信號因子,它可以進入細胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子Lef/Tcf結(jié)合，并且啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進惡性腫瘤細胞的增殖、浸潤,并且進一步促進新生血管形成,抑制細胞凋亡[7]。相關(guān)的靶基因有c-myc、CCND1、MMP-7和WISPI等，這些相關(guān)基因參與了許多惡性腫瘤的形成與發(fā)展。

在腫瘤細胞中，Wnt/β-catenin信號通路可以誘導(dǎo)各種生長因子及其受體的表達(如c-met酪氨酸激酶)，從而進一步調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖；它能夠上調(diào)抗凋亡蛋白(如caspase抑制劑、Survivin)，并能進一步抑制腫瘤細胞凋亡；同時能通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子進而刺激血管增殖；同時也上調(diào)細胞外基質(zhì)降解蛋白 MMP-7、MMP-26，并促進腫瘤細胞的進一步遠處侵襲和轉(zhuǎn)移[8-10]。在許多惡性血液病中，發(fā)現(xiàn)了Wnt/β-catenin 通路的異常激活，主要見于多發(fā)性骨髓瘤、慢性髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、急性白血病等，這一通路對腫瘤細胞具有重要的促進增殖等作用[11]。

王寧等[12]研究表明，褐藻糖膠能夠誘導(dǎo)骨髓瘤RPMI8226細胞凋亡，同時也能夠明顯抑制Wnt信號通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子的表達。Bjorklund等[13]研究顯示，褐藻糖膠通過抑制Wnt信號通路的相關(guān)基因表達，從而誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226出現(xiàn)凋亡，說明褐藻糖膠有顯著抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，褐藻糖膠作用于多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞，增殖抑制作用呈現(xiàn)出時間-劑量的關(guān)系；多發(fā)性骨髓瘤細胞經(jīng)過褐藻糖膠25 μg/mL處理72 h后，β-catenin和c-myc蛋白表達水平均明顯降低，其作用與Wnt/β-catenin抑制劑相似。提示褐藻糖膠能夠明顯抑制Wnt/β-catenin通路和β-catenin蛋白、c-myc蛋白的表達，從而抑制一系列的細胞信號傳導(dǎo)，進而抑制腫瘤細胞的增殖及分化、轉(zhuǎn)移等細胞活動，可能對多發(fā)性骨髓瘤患者的治療及預(yù)后有非常積極的臨床意義。當(dāng)然，褐藻糖膠也可能通過其他的信號通路及信號傳導(dǎo)抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等，有待于深入研究。

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Study on the effect of fucoidan on Wnt/ β-catenin pathway in multiple myeloma cell line RPMI8226

LI Yan1, LI Jing2, YAN Guiyan1, LUO Jianmin3, HAO Hongling1, WANG Suyun1, LI Jie1, YANG Jie1, YUAN Jun1, WANG Ruicang1, ZHANG Peijun4

(1.Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050000, Hebei, China; 2.Hebei Province Hospital of TCM, Shijiazhuang 050011, Hebei, China; 3.The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei, China; 4.Hospital of Gaobeidian City, Gaobeidian 074000, Hebei, China)

Objective It is to investigate the changes of Wnt/β-catenin pathway in apoptosis of fucoidan induced multiple myeloma cell line RPMI8226. Methods The apoptosis of multiple myeloma cell line RPMI8226 was induced by fucoidan, then the inhibiting rate of proliferation of the cells were observed after induction for 24, 48 and 72 h with 10, 25, 50, 100 μg/mL of fucoidan. The cells were divided into 3 groups: blank group was given no intervention of medicine, fucoidan group was given 25 μg/mL for culture, Wnt channel inhibitor (DKK-1) group was given DKK-1 for culture. Apoptosis rate of RPMI822 cells in the three groups were detected by AnnexinV-FITC/PI double staining method, and the expression of β-catenin and c-myc protein was detected by Western blot method. Results With the increase of concentration and effect time of Fucoidan, the inhibition rate of proliferation of multiple myeloma cells increased signficantly (P<0.05). The apoptosis rate of fucoidan group was obviously higher than that in the blank group; the levels of expression of β-catenin and c-myc protein in fucoidan group and DKK-1 group were significantly lower than that in blank group (P<0.05), but there was no significant difference in the levels between fucoidan group and DKK-1 group(P>0.05). Conclusion Fucoidan can induce the apoptosis of multiple myeloma cell line RPMI8226, the effect is similar to DKK-1, and it can effectively inhibit the activation status of Wnt/β-catenin pathway, this may provide some theoretical evidences for the treatment of multiple myeloma.

fucoidan; multiple myeloma cell line PTMI8226; Wnt/β-catenin pathway; β-catenin

李燕，女，主治醫(yī)師，碩士，研究方向為惡性血液病的診治。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.23.007

R-33

A

1008-8849(2015)23-2530-03

2015-01-18