依達(dá)拉奉對(duì)戊四氮致癇大鼠海馬氨基酸遞質(zhì)通路的影響

李 飛，成祥林

(長(zhǎng)江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/湖北省荊州市第一人民醫(yī)院，湖北 荊州 434000)

依達(dá)拉奉對(duì)戊四氮致癇大鼠海馬氨基酸遞質(zhì)通路的影響

李 飛，成祥林

(長(zhǎng)江大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/湖北省荊州市第一人民醫(yī)院，湖北 荊州 434000)

目的 探討依達(dá)拉奉對(duì)戊四氮(PTZ)致癇大鼠海馬氨基酸遞質(zhì)通路的影響。方法 將36只成年Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、模型組(M組)和依達(dá)拉奉組(E組)，觀察3組大鼠的行為學(xué)和腦電圖情況，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定各組大鼠海馬γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和谷氨酰胺合成酶的含量。結(jié)果 與M組相比，E組大鼠癲癇發(fā)作程度和腦電圖改變以及海馬γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的含量均明顯下降(P均<0.05)，而谷氨酰胺合成酶的含量則明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 依達(dá)拉奉可通過(guò)降低癲癇大鼠海馬γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體含量和增強(qiáng)谷氨酰胺合成酶表達(dá)以達(dá)到對(duì)抗癲癇的效果。

癲癇;戊四氮;依達(dá)拉奉;大鼠

依達(dá)拉奉是目前發(fā)現(xiàn)有效的自由基清除劑，臨床發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗癲癇作用，但是其深層的作用機(jī)制還不是很清楚。本研究旨在通過(guò)觀察依達(dá)拉奉對(duì)戊四氮(PTZ)致癇大鼠行為學(xué)、腦電圖及海馬γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GAT)和谷氨酰胺合成酶(GS)的影響，探討依達(dá)拉奉抗癲癇的深層機(jī)制，并反證自由基與氨基酸遞質(zhì)在癲癇發(fā)病中的相互作用機(jī)制，為癲癇的治療和預(yù)防提供新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 儀器與試劑 PTZ及多聚甲醛均為Sigma公司產(chǎn)品，兔抗GAT和GS抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，羊抗兔抗體和DAB染色劑由邁新公司提供，依達(dá)拉奉由南京先聲藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物的分組與處理 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量280～340 g,武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：[E]2008-005。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、模型組(M組)和依達(dá)拉奉組(ED組)，每組12只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于正常晝夜環(huán)境中，正常進(jìn)食水。

1.3 動(dòng)物模型制備及腦電圖記錄 清醒狀態(tài)下將大鼠固定，采用頭皮針電極、雙極導(dǎo)聯(lián)法(額-頂)連接。電極分別取兩眼連線中點(diǎn)(額葉)及兩耳連線中點(diǎn)(頂葉)插入固定,鼻根部接地線。M組與ED組大鼠腹腔注射PTZ 60 mg/kg制作癲癇模型[1]，NC組注射等劑量的生理鹽水,觀察3組大鼠行為表現(xiàn)。ED組在造模前1 h、0.5 h、造模即刻分別予以注射依達(dá)拉奉3 mg/kg[2]，M組與NC組予以等量生理鹽水代替。3組完成注射后均觀察1 h并記錄腦電圖。

1.4 行為學(xué)觀察 參照Racine癲癇發(fā)作行為標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行觀察記錄。Ⅰ級(jí)：面肌抽動(dòng)；Ⅱ級(jí)：節(jié)律性動(dòng)頭；Ⅲ級(jí)：前肢抽搐；Ⅳ級(jí)：軀干及前肢陣攣，Ⅴ級(jí)：四肢抽搐，全身陣攣。

1.5 標(biāo)本采集、處理及指標(biāo)測(cè)定 觀察1 h后，3組大鼠均行心臟灌注固定，斷頭取腦，大鼠腦組織(含海馬)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(厚度4 μm)。每只鼠隨機(jī)選取4張切片，這些切片的斷面水平在各鼠均相似。每只大鼠選擇4張腦片，2張用于GAT的檢測(cè)，2張用于GS的檢測(cè)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法(S-P法，按說(shuō)明書進(jìn)行)測(cè)定3組大鼠海馬GAT和GS的陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞平均吸光度，每張切片的每個(gè)區(qū)域隨機(jī)選擇3個(gè)高倍視野進(jìn)行測(cè)定。對(duì)所選腦區(qū)運(yùn)用HPIAS-200型圖像分析軟件進(jìn)行陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞平均度和陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)分析。陽(yáng)性反應(yīng)為棕色顆粒，顏色越深，吸光度值越大。

2 結(jié) 果

2.1 行為變化M組大鼠給藥以后平均56s左右出現(xiàn)眨眼、動(dòng)須、節(jié)奏性咀嚼、節(jié)律性點(diǎn)頭、肢體抽搐等表現(xiàn)，其中9只出現(xiàn)Ⅴ級(jí)發(fā)作，2只出現(xiàn)Ⅳ級(jí)發(fā)作，1只出現(xiàn)Ⅲ級(jí)發(fā)作。ED組大鼠給藥以后平均12min左右出現(xiàn)眨眼、動(dòng)須、節(jié)奏性咀嚼、節(jié)律性點(diǎn)頭、肢體抽搐等表現(xiàn)，其中1只出現(xiàn)Ⅳ級(jí)發(fā)作，1只出現(xiàn)Ⅲ級(jí)發(fā)作，7只出現(xiàn)Ⅱ級(jí)發(fā)作，3只出現(xiàn)Ⅰ級(jí)發(fā)作。NC組給藥前后均無(wú)明顯變化。

2.2 腦電圖變化NC組大鼠腦電圖表現(xiàn)為α或β波；M組鼠均出現(xiàn)陣發(fā)性癇性放電,表現(xiàn)為高電位的棘波、尖波、棘- 慢復(fù)合波、尖-慢復(fù)合波；ED組部分大鼠有尖波、棘-慢復(fù)合波、尖-慢復(fù)合波出現(xiàn)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠腦電圖表現(xiàn)比較 只

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果ED組海馬GAT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和光密度較M組降低(P均<0.01)，但較NC組增高(P均<0.05)；ED組海馬GS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和光密度較M組升高(P均<0.01)，但較NC組降低(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討 論

表2 3組海馬GAT和GS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞平均吸光度

注:①與M組比較，P<0.01;②與NC組比較,P<0.05。

癲癇是大腦神經(jīng)元的突發(fā)性異常發(fā)電的短暫一過(guò)性大腦功能障礙的慢性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全清楚。多數(shù)研究證明癲癇動(dòng)物模型或臨床癲癇患者中存在著中樞性氨基酸遞質(zhì)的變化，通過(guò)局部或全身調(diào)節(jié)氨基酸含量可以誘發(fā)或抑制癲癇發(fā)作，提示氨基酸遞質(zhì)在癲癇發(fā)病中起著重要作用[4]。谷氨酸是中樞內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其導(dǎo)致的神經(jīng)元興奮性活動(dòng)由不同的亞型受體介導(dǎo)[5]。GS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)谷氨酸代謝的重要酶之一，它催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺[6]，降低谷氨酸含量。GS與癲癇的形成有關(guān)系，其機(jī)制可能為：GS表達(dá)減少或活性降低，谷氨酸向谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化減少，引起細(xì)胞外液中的谷氨酸堆積，從而改變影響了神經(jīng)元的功能，最后導(dǎo)致了癲癇的形成[7]。在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，NC組的GS含量較M組明顯增高，這也進(jìn)一步證實(shí)了GS在癲癇發(fā)病中的作用；同時(shí)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)還存在抑制性氨基酸[γ-氨基丁酸(GABA)]，許多神經(jīng)生理學(xué)研究提示GABA介導(dǎo)的抑制性傳導(dǎo)異常或缺失是癲癇發(fā)作時(shí)神經(jīng)元高興奮性的主要原因[8]。GAT介導(dǎo)GABA的攝取和滅活，調(diào)節(jié)GABA能神經(jīng)傳導(dǎo)，是GABA介導(dǎo)的抑制性傳導(dǎo)的生化基礎(chǔ)。GAT含量的增高必將導(dǎo)致突觸間隙GABA的減少，參與癲癇的發(fā)病過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NC組的GAT含量較M組明顯降低，進(jìn)一步佐證了GAT參與了癲癇的發(fā)病過(guò)程。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作會(huì)導(dǎo)致自由基產(chǎn)物增多,并會(huì)損傷細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)和DNA,線粒體在癲癇導(dǎo)致的自由基增多中起重要作用[9]。在癲癇急性發(fā)作的病理過(guò)程中大腦內(nèi)產(chǎn)生的活性氧和超氧化物的量大大增加,過(guò)量產(chǎn)生的自由基通過(guò)滅活谷氨酰胺合成酶來(lái)促進(jìn)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的異常增加,使其在細(xì)胞外蓄積產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性。而興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)(EAAs)在癲癇持續(xù)狀態(tài)和慢性癲癇所致的神經(jīng)元損傷發(fā)生中起重要作用[10]。氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙參與了神經(jīng)元死亡和癲癇發(fā)作。并且在癲癇發(fā)生過(guò)程中起重要作用[11]。目前認(rèn)為，依達(dá)拉奉作為一個(gè)有效的自由基清除劑，其神經(jīng)保護(hù)效果是通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化實(shí)現(xiàn)的[12]。有證據(jù)表明，抗氧化劑治療可以減少誘導(dǎo)氧自由基在一些動(dòng)物驚厥模型的病變[13]。

本研究結(jié)果表明依達(dá)拉奉可以明顯延長(zhǎng)癲癇的發(fā)作潛伏期、降低發(fā)作程度,減少腦電圖癲癇波的發(fā)放，說(shuō)明自由基清除劑依達(dá)拉奉可以幫助控制癲癇的發(fā)作；而同時(shí)ED組中大鼠海馬組織中GAT減少，提示依達(dá)拉奉可能通過(guò)抑制自由基的產(chǎn)生和配套的抗氧化還原系統(tǒng)的保護(hù)作用[14],或間接增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA而控制癲癇發(fā)作，從而降低癲癇的致殘率和病死率,對(duì)癲癇治療有益,值得臨床上推廣使用。但依達(dá)拉奉不能完全拮抗癲癇，可以作為癲癇的輔助治療。

綜上所述,癲癇活動(dòng)伴有活躍的自由基反應(yīng),清除自由基,阻斷自由基反應(yīng)給癲癇的預(yù)防和治療開(kāi)辟了新的領(lǐng)域。由于引起癲癇的因素是多方面的,單純使用自由基清除劑治療癲癇難以達(dá)到理想的效果,還需與抗癲癇藥物聯(lián)合應(yīng)用。但筆者可以預(yù)見(jiàn),進(jìn)一步探索癲癇發(fā)生的自由基病理機(jī)制,開(kāi)發(fā)有效清除自由基的藥物具有廣闊的前景。

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Effects of edaravone on the amino acid neurotransmitter pathway from the hippocampus in pentylenetetrazol-induced epileptic rats

LI Fei, CHENG Xianglin

(Clinical Medical College of Changjiang University/The First People’s Hospital of Jingzhou,Jingzhou 434000,Hubei,China)

Objective It is to investigate the effects of edaravone on the amino acid pathway from the hippocampus in pentylenetetrazol (PTZ)-induced epileptic rats. Methods 36 adult Wistar rats were randomly divided into normal control group(NC group), epileptic model group(M group) and edaravone group (ET group). The changes of behavior and EEG were observed in rats of the three groups. The expression of hippocampal γ-aminobutyric acid transporter and glutamine synthetase at protein level was detected by immunohistochemistry. Results Compared with that in M group, epileptic degree and EEG changes and the expression of hippocampal γ-aminobutyric acid transporter was significantly decreased (P<0.05), while the expression of glutamine synthetase was significantly increased in ET group(P<0.05).Conclusion Edaravone could ameliorate epilepsy via a decrease of the expression of hippocampal γ-aminobutyric acid transporter and an increase of the expression of glutamine synthetase in pentylenetetrazol (PTZ)-induced epileptic rats.

epilepsy; pentylenetetrazole; edaravone; rat

李飛，男，主治醫(yī)師，研究生在讀，研究方向?yàn)榧蔽Ｖ匕Y。

成祥林，E-mail：cheng066@tom.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.23.008

R-332

A

1008-8849(2015)23-2533-03

2014-06-25