疏肝健脾法對潰瘍性結腸炎結腸黏膜中PPAR-γ相關因子基因和蛋白表達的影響

肖永峰

(河北省河間市人民醫院，河北 河間 062450)

疏肝健脾法對潰瘍性結腸炎結腸黏膜中PPAR-γ相關因子基因和蛋白表達的影響

肖永峰

(河北省河間市人民醫院，河北 河間 062450)

目的研究疏肝健脾法對潰瘍性結腸炎結腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達的影響。方法將60只正常大鼠隨機分為正常組、模型組、研究1組、研究2組、研究3組、研究4組，每組10只。正常組不做任何處理，其他組均使用TNBS/乙醇灌腸、再用束縛法+飲食失節的復合方法建立大鼠肝郁脾虛型潰瘍性結腸炎模型。造模成功后，模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌腸，研究1組、研究2組、研究3組、研究4組分別采用5倍(10g/kg)、10倍(20g/kg)、15倍(30g/kg)、20倍(40g/kg)成人劑量的疏肝健脾的中藥痛瀉要方溶液灌胃治療。治療4周后，將大鼠集體處死，觀察各組結腸黏膜情況、PPAR-γ蛋白表達平均光密度值和結腸黏膜PPAR-γ基因表達情況。結果模型組和研究1組、研究2組、研究3組、研究4組大鼠結腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白的表達量均明顯低于正常組(P均<0.05)；研究1組、研究2組、研究3組、研究4組結腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達量均明顯高于模型組(P均<0.05),研究4組結腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達量均明顯高于研究1組、研究2組、研究3組(P均<0.05)。結論潰瘍性結腸炎會影響結腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達，疏肝健脾的痛瀉要方中藥可以提高結腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達，且呈劑量依賴性。

疏肝健脾法；潰瘍性結腸炎；PPAR-γ；痛瀉要方

潰瘍性結腸炎是常見的腸道疾病之一，其發病原因尚不明確，但發病率逐年增高，且復發率、癌變率高[1]。該病病程長，易反復，常呈慢性病變。臨床癥狀主要有腹痛、腹瀉，糞便中夾有黏液，排便次數逐漸增多，里急后重，腹痛常排便后減輕，隨病情的發展會出現便血、膿血、糊狀黏液便和水樣便等，患者常痛苦不堪[2]。目前臨床尚無特效治療藥物，只能控制癥狀，且效果不佳，容易出現消化道出血、腸瘺等并發癥，多數患者家庭難以承受長期的經濟壓力[3]。目前潰瘍性結腸炎的發病機制尚不明確，可能與PPAR-γ相關因子基因和蛋白表達有關，使用PPAR-γ激動劑治療潰瘍性結腸炎療效較好[4]。本研究探討了疏肝健脾法對潰瘍性結腸炎小鼠結腸黏膜中PPAR-γ相關因子基因和蛋白表達的影響，旨在為該病的治療提供理論依據。

1 實驗資料

1.1實驗動物 健康大鼠60只，體質量170～200 g ，動物合格證號：1310017，許可證號：SCXK(冀)2013-003。

1.2試劑和藥物 痛瀉要方組成：陳皮、白術、白芍、防風比例為3∶2∶1∶1，用70%乙醇提取藥液，成人量為2 g/kg。

1.3動物分組及造模 將60只正常大鼠隨機分為正常組、模型組、研究1組、研究2組、研究3組、研究4組，每組10只。正常組不做任何處理，其他組均用0.03 mL/10 g的10%水合氯醛對大鼠進行腹腔麻醉，將100 mg/kg TNBS再加上50%乙醇0.25 mL混合試劑灌腸(用橡膠輸液管輕緩將試劑注入大鼠距肛門7～8 cm深的腸腔內)，留置10 min，再用空針頭抽取5～10 mL的空氣以同樣的方法注入大鼠腸腔內。再用束縛法和飲食失節的復合方法建立大鼠肝郁脾虛型模型：將大鼠四肢束縛住，不讓其隨意動彈，飲食不能足量，讓其在饑餓、疲憊的環境中呆2 d，達到肝郁脾虛狀態。

1.4給藥方法 正常組不做任何處理。模型組給予0.9%氯化鈉溶液灌腸；研究1組、研究2組、研究3組、研究4組分別采用5倍(10 g/kg)、10倍(20 g/kg)、15倍(30 g/kg)、20倍(40 g/kg)成人劑量的疏肝健脾的中藥痛瀉要方溶液灌胃治療，均1次/d。

1.5觀察指標 治療4周，用肉眼觀察大鼠的體型，然后將大鼠集體采用脫頸椎法處死，并迅速剖腹，將肛門以上結腸(約8 cm)取出，沿腸系膜緣剪開腸腔，用冷磷酸鹽緩沖液沖洗腸內容物，肉眼觀察大鼠結腸黏膜組織的形態，然后選擇病變最明顯的一段約0.5 cm組織，將其迅速置入液氮中予以保存，使用4%中性多聚甲醛固定部分結腸組織，做病理切片，脫水，滴加3% H2O2，放置10 min，然后將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中予以抗原熱修復，自然冷卻后，滴入5% BSA封閉液放置約20 min，再滴入PPAR-γ一抗，在4 ℃冰箱中保存24 h，取出滴加生物素化山羊抗兔IgG，然后轉移至37 ℃培養箱中孵育20 min，滴加SABC試劑繼續在培養箱中孵育20 min，之后使用蘇木素與DAB顯色劑輕度復染約3 min，乙醇脫梯度水，二甲苯透明，予以中性樹膠封片處理，最后使用顯微鏡觀察分析。鏡下PPAR-γ胞質為黃褐色顆粒染色為陽性，顏色越深表達越強，若無棕黃褐色顆粒顯現則為陰性，然后再隨機選擇5個視野，使用BI-2000圖像，予以免疫組化分析系統處理，對呈現出的陽性細胞進行測量，計算其平均灰度值，灰度值越大表明該蛋白的表達越多。使用上海信裕生物科技有限公司的PPAR-γ檢測試劑盒檢測PPAR-γ蛋白表達量。

1.6結腸黏膜組織大體形態損傷評分標準[5]參照Luketal標準進行評分：無損傷計為0分；有充血但沒有壁層變厚和潰瘍計為1分；充血伴有腸壁變厚但沒有潰瘍計為2分；有單處直徑0～1 cm以內的潰瘍計3分；有2處和2處以上、直徑1～2 cm的潰瘍，但腸管與外周臟器無粘連計4分；有2處和2處以上，直徑2 cm以上的潰瘍，腸管增厚，并且與周圍臟器粘連嚴重者計5分。

2 結 果

2.1肉眼觀察結果 正常組大鼠活動自如，飲食、體型、大便正常，結腸黏膜組織正常；各造模組大鼠飲食減少，活動減少，出現消瘦、腹瀉，結腸黏膜組織炎癥和潰瘍形成，說明造模成功。治療4周后，正常組大鼠結腸黏膜組織正常，模型組和研究1組、研究2組、研究3組、研究4組大鼠結腸黏膜均可見不同程度的充血、水腫、腸壁變厚、潰瘍、腸道縮短等表現，但研究1組、研究2組、研究3組、研究4組大鼠的結腸黏膜損傷情況均明顯輕于模型組，并且隨著痛瀉要方濃度的增高，結腸黏膜損傷情況越輕。

2.2各組大鼠黏膜損傷評分 正常組、模型組、研究1組、研究2組、研究3組、研究4組黏膜損傷評分分別為(0.07±0.02)分、(3.24±1.13)分、(2.14±1.53)分、(1.73±1.25)分、(1.07±0.78)分、(0.14±0.12)分。隨著痛瀉要方濃度的增高，黏膜損傷評分明顯降低，各組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。

2.3各組大鼠結腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達情況 模型組、研究1組、研究2組、研究3組、研究4組結腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達量均明顯低于正常組(P均<0.05)；研究1組、研究2組、研究3組、研究4組結腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達量均明顯高于模型組,而且研究4組結腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達量均明顯高于研究1組、研究2組、研究3組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠結腸黏膜PPAR-γ基因和蛋白表達情況

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與研究4組比較，P<0.05。

3 討 論

潰瘍性結腸炎是一種非特異炎癥性腸病，致病因素與發病機制均較為復雜。目前研究顯示，該病與免疫反應交互性、環境、遺傳易感性等緊密相關，其中腸道免疫失衡是該病的重要發病機制，這種免疫失衡下，機體各種炎性遞質及細胞因子互相作用與影響，促進了炎癥反應，從而造成腸黏膜損傷[5-6]。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)可以與一些處于基因上游的、具有特異性的PPAP反應元件作用，從而達到調控基因表達的作用；PPARs屬于配體激活核轉錄因子，也是核激素受體轉錄因子超家族成員之一[7]。PPAR-γ作為PPARs的亞型，在脂肪組織、大腸等組織中有著高表達，在腎臟、肝臟、小腸以及骨骼肌中有一定表達，其主要存在于脂肪組織與免疫系統中，除了在胰島素致敏、脂肪代謝方面有調控作用外，還對炎癥反應、動脈粥樣硬化、細胞增殖分化等有著十分重要的調控作用，與潰瘍性結腸炎有緊密關聯[8]。PPAR-γ抗炎癥反應機制復雜，有研究表明，其對炎癥的抑制作用是經抑制核因子NF-κB介導信號轉導通路來實現的[9]。但當前PPAR-γ在腸道免疫炎癥反應中的作用機制還未完全明了。目前對PPAR-γ在潰瘍性結腸炎發病中的機制研究一般多以動物為研究對象。柯希權等[10]應用3%葡聚糖硫酸鈉制備大鼠急性潰瘍性結腸炎模型，結果表明益生菌可降低大鼠結腸組織學評分及DAI積分，增加結腸長度，提高結腸黏膜中PPAR-γ的表達。卞紅磊等[11]和張燕等[12]應用復2,4-二硝基氯苯十乙酸建立潰瘍性結腸炎大鼠模型，并使用免疫組化法檢測結腸黏膜中PPAR-γ的表達水平，結果顯示，大鼠結腸黏膜上皮PPAR-γ表達明顯減少，通過柳氮磺胺吡啶治療后，大鼠結腸黏膜上皮PPAR-γ表達明顯升高。苗新普等[13]研究顯示，潰瘍性結腸炎炎癥組織中PPAR-γ表達水平明顯低于正常組織，炎癥越嚴重，其表達水平則越低，由此可見PPAR-γ相對于潰瘍性結腸炎屬于一種負性調控因子。梁紅亮等[14]研究表明PPAR-γ對NF-KB活化劑結腸上皮細胞凋亡有抑制作用，且其配體吡格列酮也可以促進PPAR-γ的表達，最終達到治療結腸炎癥的目的。

中醫認為潰瘍性結腸炎屬“泄瀉”“痢疾”范疇，該病與肝郁脾虛有關，主張采用疏肝健脾法治療[15]。痛瀉要方出自《丹溪心法》,方中白術祛濕健脾治脾虛；白芍酸甘斂陰，柔肝止痛；陳皮行氣健脾，防風升散疏肝[16]。諸藥合用補脾柔肝，祛濕止瀉，以達到疏肝健脾的功效,是治療肝郁脾虛所致腹瀉的代表方[17]。本實驗結果表明，潰瘍性結腸炎大鼠的結腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達均低于正常大鼠，給予痛瀉要方中藥灌胃治療可以提高大鼠結腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達，而且隨著痛瀉要方中藥濃度的升高，結腸黏膜中PPAR-γ相關因子基因和蛋白表達越高，說明治療效果越好。

綜上所述，潰瘍性結腸炎會影響結腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達，疏肝健脾的痛瀉要方可以提高結腸黏膜中PPAR-γ基因和蛋白表達水平，為其臨床應用提供了理論依據。

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Effect of soothing liver and invigorating spleen method on the expression of PPAR-gamma correlated factor gene and protein in colonic mucosa of ulcerative colitis

XIAO Yongfeng

(The People's Hospital of Hejian City, Hejian 062450, Hebei, China)

Objective It is to study the effect of soothing liver and invigorating spleen method on PPAR-gamma correlated factor gene and protein in colonic mucosa of ulcerative colitis. Methods 60 normal rats were randomly divided into normal group,model group, study group Ⅰ, study group Ⅱ, study group Ⅲ, study group Ⅳ, each group had 10 rats. All the rats except in normal group were used to establish liver stagnation and spleen deficiency type of ulcerative colitis model by the methods of TNBS/ethanol enema, binding method + inproper diet. After success establish of the models, model group was given 0.9% sodium chloride solution by enema, and the study group Ⅰ,study group Ⅱ, study group Ⅲ, study group Ⅳ were given 5 times, 10 times, 15 times, 20 times Tongxieyaofang which could sooth liver and invigorate spleen by intragastric administration. After treating for 4 weeks, all the rats were killed to observe colonic mucosa injury and the average optical density value of the expression of PPAR-protein and PPAR-gene in colonic mucosa. Results The expression of PPAR-gamma correlated factor gene and protein in colonic mucosa of the rats in model group and the study groups were significantly lower than that in normal group (P<0.05), and the expression in the study groups were higher than that in model group (P<0.05), the expression in study group IV was higher than that in the other three study groups (P<0.05). Conclusion Ulcerative colitis can influence the expression of PPAR-gamma correlated factor gene and protein, soothing liver and invigorating spleen decoction Tongxieyaofang can increase the expression of PPAR-gamma correlated factor gene and protein in colonic mucosa with a dose dependence.

Shuganjianpi therapy; ulcerative colitis; PPAR- gamma; Tongxieyaofang

肖永鋒，男，主治醫師，從事中醫內科臨床工作，擅長腫瘤、消化系統疾病的中西醫綜合治療。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.28.008

R0714.433

A

1008-8849(2015)28-3101-03

2014-09-30