黃芩莖葉中主要化學成分的動態變化研究

呂維紅，王洪斌，吳俊平，王曉琦，陳麗潔，張文嶺

(1. 河北省滄州市人民醫院， 河北 滄州 061000；2. 河北省青縣中醫院，河北 青縣 062650；3. 河北省青縣新興中心衛生院，河北 青縣 062650；4. 河北省滄州市食品藥品檢驗所，河北 滄州 061000)

藥物研究

黃芩莖葉中主要化學成分的動態變化研究

呂維紅1，王洪斌2，吳俊平3，王曉琦4，陳麗潔1，張文嶺1

(1. 河北省滄州市人民醫院， 河北 滄州 061000；2. 河北省青縣中醫院，河北 青縣 062650；3. 河北省青縣新興中心衛生院，河北 青縣 062650；4. 河北省滄州市食品藥品檢驗所，河北 滄州 061000)

目的通過高效液相色譜法測定黃芩莖葉主要成分的動態變化，確定其最佳采收期。方法應用高效液相色譜法測定不同采收期黃芩葉主要成分的動態變化，色譜柱為Phenomenex-C18(250mm×4.6mm，5μm)，檢測波長為276nm，流動相為甲醇-水-2%磷酸梯度洗脫。結果隨采收期的不同黃芩莖葉中野黃芩苷與黃芩苷的含量也不同，野黃芩苷在5月份開花前含量最高，黃芩苷在4月發芽期含量最高。結論黃芩莖葉采收期定于5月份開花前采收，此時野黃芩苷含量最高。

黃芩莖葉；采收期；野黃芩苷；黃芩苷；動態變化

黃芩莖葉為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥地上部分，其有效部位為黃芩莖葉總黃酮。主要分布于河北、山東、河南、黑龍江、吉林、遼寧、云南、內蒙古等地，其化學成分主要包括野黃芩苷、黃芩苷、芹菜素苷、白楊素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等黃酮類化合物[1]，其中野黃芩苷和黃芩苷的藥理作用研究較多。藥理學研究發現黃芩莖葉總黃酮具有較強的抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗心律失常、降血壓、降血脂、提高機體免疫力和改善記憶等藥理學活性[2]。目前由東北亞藥業公司研制的“黃芩莖葉解毒膠囊”以中藥二類新藥的身份成功用于急性咽炎、急性扁桃體炎等上呼吸道感染[3]。其中黃芩地上部分的莖和葉還作為“黃芩茶”代茶飲用，具有清熱燥濕、瀉火解毒、消炎、促消化等作用，民間稱為黃芩茶、黃金茶等[4]。隨著黃芩莖葉總黃酮的研究的不斷深入，對黃芩莖葉的質量要求也越來越高，不同的采收期對黃芩莖葉質量影響很大，如何提供質量高、產量大的藥材已經成為目前重點研究的內容。本實驗通過建立HPLC法[5]，以不同采收期栽培的黃芩莖葉作為樣品，以野黃芩苷與黃芩苷為成分指標[6]，分析一年當中黃芩莖葉中野黃芩苷與黃芩苷含量的動態變化，通過野黃芩苷與黃芩苷的含量變化確定黃芩莖葉的最佳采收期，旨在為今后深入研究野黃芩苷與黃芩苷在黃芩生長等方面所產生的生理作用，為黃芩的規范化生產、最佳采收期的確定以及黃芩的綜合開發提供理論依據。

1 實驗資料

1.1儀器Phenomenex-C18柱(250mm×4.6mm，粒度5μm)色譜柱(迪馬公司)；WR-2001型溶劑過濾器(上海嘉鵬科技有限公司)；METTLERAE240型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)；SHANGPINGFA1104型電子天平(上海天平儀器廠)；2000D型超純水器(北京市長風儀器儀表公司)；KQ-2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Agilent1200高效液相色譜儀；AgilentVWD檢測器；AgilentChemstation工作站(美國安捷倫科技公司)等。

1.2試藥 野黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110842-200504)；黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號l10715-200212)；甲醇(色譜純，天津市四友精細化學品有限公司)；磷酸(色譜純，天津科密歐化學試劑開發中心)，95%乙醇(分析純，煙臺三和化學試劑有限公司)，水為超純水(新鮮配制)。

1.3供試材料 黃芩于2012年4月份種植于河北省滄州市黃芩研究基地，自種植之日起，每月采收黃芩地上部分1次，直至秋天葉落枯黃為止。原植物經河北省滄州市人民醫院呂維紅主任藥師鑒定，為唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的地上部分。

1.4實驗方法

1.4.1色譜條件 選擇比較常用的C18色譜柱：Phenomenex-C18柱色譜柱；流動相經過篩選，選擇甲醇(MEOH)-水(H2O)-磷酸(H3PO4)進行梯度洗脫；276nm為檢測波長，柱溫為30℃，進樣體積5μL。流動相梯度洗脫條件見表1。

1.4.2對照品溶液的制備 精密稱定干燥至恒重的野黃芩苷對照品145.00mg，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，記為A溶液。精密稱定干燥至恒重的黃芩苷對照品41.40mg，置于于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，記為B溶液。分別從A溶液中吸取10mL，從B溶液中吸取5mL置于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即配成所需混合對照品溶液(含野黃芩苷0.5856mg/mL、黃芩苷0.0828mg/mL)。

表1 黃芩莖葉梯度洗脫流動相組成 %

1.4.3供試品溶液的制備 將上述不同采收期黃芩莖葉樣品自然曬干，經粉碎，過60目篩后備用。精密稱取黃芩莖葉粗粉0.2g，加入70%乙醇25mL，稱量，加熱回流3h，放置室溫，用70%乙醇補足減少的質量，取上清液用0.45μm濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

1.4.4系統適應性實驗

1.4.4.1線性范圍考察 精密吸取混合對照品溶液(含野黃芩苷0.5856mg/mL、黃芩苷0.0828mg/mL)1.25，2.5，5，10，15，20μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定野黃芩苷和黃芩苷的色譜峰面積，以色譜峰峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸，計算回歸方程分別為：野黃芩苷y=144.33x-66.208，r=0.9998；黃芩苷y=90.984x-22.671，r=0.9999。結果表明：野黃芩苷在0.1063～1.700μg范圍內與其色譜峰面積呈良好的線性關系；黃芩苷在 0.0185～0.2960μg范圍內與其色譜峰峰面積呈良好的線性關系。見表2。

表2 不同進樣體積色譜峰峰面積比較 mAU·min

1.4.4.2精密度考察 精密吸取1.4.3項下制得的黃芩莖葉供試品溶液1份，連續進樣6次每次進樣量為5μL，按上述色譜條件，測得野黃芩苷與黃芩苷的峰面積，其RSD分別為0.29%和0.84%，說明儀器的精密度良好。見表3。

表3 精密度考察結果 mAU·min

1.4.4.3穩定性考察 精密吸取1.4.3項下制得的黃芩莖葉供試品溶液1份，分別在0,2,4,8,12,24,48h進樣，進樣量5μL。按上述的色譜條件，檢測野黃芩苷和黃芩苷的峰面積，在48h內其RSD分別為0.19%和0.13%，表明樣品在48h內是穩定的。見表4。

表4 穩定性考察結果 mAU·min

1.4.4.4重復性考察 取同一批黃芩莖葉樣品6份，根據供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按上述相同的色譜條件測定含量，結果野黃芩苷的平均含量為3.9923%(RSD0.12%)，黃芩苷的平均含量為0.3523%(RSD0.46%)，說明該方法的重復性良好。見表5。

表5 重復性考察結果 %

1.4.4.5加樣回收率實驗 分別精密稱取上述已知含量的樣品6份，置25mL量瓶中，精密加入配好的野黃芩苷、黃芩苷的混合對照品溶液，按上述色譜條件測定方法進行測定，結果見表6，其中野黃芩苷的平均回收率為98.90%，RSD為0.66%；黃芩苷的平均回收率為97.53%，RSD為1.27%。

1.4.5樣品含量測定 由以上系統適應性實驗可以說明：儀器的精密度良好，樣品穩定性較好，實驗方法的重復性較好，且樣品的加樣回收率試驗符合規定。因此，按1.4.3項下的方法制備供試液樣品，按1.4.1項下的高效液相色譜條件對不同采收期的黃芩莖葉樣品進行含量測定，每批平行測定3份，按1.4.4.1項下繪制出的回歸方程計算樣品中主要化學成分黃芩苷與野黃芩苷的含量。

表6 回收率考察結果

2 結 果

將黃芩莖葉的樣品與對照品通過HPLC色譜法比較，確定野黃芩苷和黃芩苷的波譜位置，見圖1及圖2。將不同月份(4—11月)的黃芩莖葉進行含量測定發現野黃芩苷含量呈現先增后降的趨勢，5月時野黃芩苷含量上升到最高值3.99%，隨后逐步降低，在11月達到最低點0.78%。而黃芩苷的含量在4最高為2.03%，隨后下降，不過5—11月的含量差別不大。黃芩莖葉中的兩種黃酮總量與黃芩苷類似，都是含量逐月下滑，不過不同月份含量差異較大，具體結果見表7。

圖1 標準品與樣品匹配圖譜

圖2 黃芩莖葉樣品HPLC圖譜

表7 黃芩莖葉不同采收期黃酮類成分的含量(n=3) %

3 討 論

黃芩主要分布于河北、山東、黑龍江、吉林、遼寧、河南、四川、云南、山西、陜西、甘肅、內蒙古等地。黃芩始載于《神農本草經》，被列為中品，傳統藥用其根，而產量遠遠大于根的莖葉部分之前常被廢棄。由于用藥量大，野生資源日趨枯竭，為了充分利用中藥資源，近年來開始了對黃芩莖葉的化學成分和藥理活性的研究，對黃芩莖葉總黃酮藥理學研究取得了很大的進展，肯定了黃芩莖葉在上呼吸道感染、心腦血管、高血壓、高血脂、糖尿病、改善記憶力等[7-11]方面的應用。

本實驗采用高效液相色譜法對同年生不同采收期黃芩莖葉中野黃芩苷和黃芩苷的含量進行測定，結果發現，野黃芩苷

的含量呈現一種先增加后降低的趨勢，在5月含量達到最高，可能與此時黃芩莖葉處于生長旺盛階段，次生代謝物質積累較快有關。黃芩苷的含量4月最高，然后含量下降，之后含量的變化較小，其原因可能由于此時植物剛剛發芽，有效成分含量與根比較接近，所以黃芩苷的含量較高。因此，筆者認為黃芩莖葉的最佳采收期為5月，植物開花前采收，此時植物體內野黃芩苷的含量最高。

本文對不同采收期黃芩莖葉中主要化學成分野黃芩苷和黃芩苷含量的動態變化進行研究，以有效成分含量最高的月份作為黃芩莖葉的最佳采收期，確定黃芩莖葉的最佳采收期為春季開花前。黃芩傳統藥用部位為根，目前黃芩莖葉的藥理學研究已經充分肯定其較高的藥用價值，且目前有“黃芩莖葉解毒膠囊”二類新藥的誕生，為黃芩莖葉的開發利用奠定良好的基礎。本文從黃芩莖葉的有效成分的動態變化著手研究，進一步確定黃芩莖葉的最佳采收期，為開發新的藥用部位，充分利用藥用資源，減少資源浪費，實施規范化種植，保證藥材質量，提高臨床療效等提供了科學依據。

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張文嶺，E-mail:zhangwenling656@163.com

河北省中醫藥管理局項目(2013140)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.18.036

R284.1

B

1008-8849(2015)18-2030-03

2014-12-25