理化因子對谷皮菱形藻細胞密度及中性脂含量的影響

班劍嬌, 馮 佳, 王志強, 謝樹蓮

山西大學生命科學學院, 太原 030006

理化因子對谷皮菱形藻細胞密度及中性脂含量的影響

班劍嬌, 馮 佳, 王志強, 謝樹蓮*

山西大學生命科學學院, 太原 030006

以高脂微藻谷皮菱形藻(NitzschiapaleaNY025)為實驗材料，探討了利用光密度法和尼羅紅熒光染色法測定細胞生長和細胞中性脂含量的可行性，進而研究了溫度、光強及培養基中N、P、Si含量對藻細胞生長和中性脂積累的影響。結果表明：(1)谷皮菱形藻在675nm處存在最大吸收峰，細胞密度與OD675之間存在良好的線性關系，利用光密度法和尼羅紅熒光染色法表征谷皮菱形藻生物量和中性脂含量操作簡單，適用于高通量樣品的測定；(2)谷皮菱形藻在20℃，光強160 μmol m-2s-1時生長最快，在20℃，光強200 μmol m-2s-1時，有利于中性脂積累；(3)培養基中N、P、Si濃度分別為80、120、100 mg/L時，有利于谷皮菱形藻細胞生長，其中，N元素影響最大，其次是P、Si，且N、P、Si三因子以及交互作用N×P與P×Si對藻株生長作用均為顯著。培養基中N、P、Si濃度分別為80、120、50 mg/L時，利于中性脂積累，其中，N元素影響最大，其次是Si、P，且因子N、Si及交互作用N×P、N×Si作用均為顯著；(4)可采用兩步培養法，先使谷皮菱形藻細胞大量增殖，而后適當改變培養條件，以增加脂質合成。

谷皮菱形藻; 理化因子; 細胞密度; 中性脂

隨著人類社會不斷發展，對能源的需求量越來越大，已導致石油等化石能源緊缺，能源危機問題突顯。尋求潔凈的可再生能源成為目前的一個重要研究領域。生物柴油作為石油的替代品具有巨大的應用潛力，已引起了廣泛關注[1- 3]。

利用微藻資源生產生物柴油具有多方面的優點，如光合效率高，生長速度快，培養周期短，不需要占用大量耕地，而且細胞結構簡單，通過生物技術手段易于改造，油脂組成符合生物柴油生產的要求等。因此，微藻也被認為是最有潛力的生物柴油生產原料[4]。

目前，關于微藻的選育已有一些報道[5- 7]。谷皮菱形藻(Nitzschiapalea)隸屬于硅藻門(Bacillariophyta)，菱形藻科(Nitzschiaceae)，廣泛分布于江河湖海等各種水體中，為廣鹽性藻種[8]，是一種在水產養殖方面極具經濟價值的種類[9]。作者在前期研究中已發現該種具有生長速度快、油脂產率高的特點，是一種較理想的高脂藻種[10]。

硅藻內部的理化成分與其生長的環境相關[11- 12]，溫度、光強、pH、培養基成分等的改變都會影響細胞內部脂質含量與組成。利用各種培養條件的優化，可以實現藻細胞內部油脂含量的提升。本文以作者前期篩選的一株高脂谷皮菱形藻為研究對象，進行了溫度、光強和培養基中N源、P源、Si源的用量對該藻生長量及中性脂積累量的逐級優化，以期為開發微藻生物柴油種質資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及培養

谷皮菱形藻(NitzschiapaleaNY025)，分離自山西省汾河上游，為作者前期篩選到的具產油潛力藻株。將實驗材料接種至D1培養基進行擴大培養，至對數期時進行后續實驗。正交實驗中，通過在D1培養基中添加相應量的N源、P源、Si源對該藻株進行優化培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 OD值與細胞密度線性關系的確立

開啟紫外可見分光光度計進行聯機操作。取谷皮菱形藻藻液，以D1培養基為對照，進行最大吸收峰的波長掃描，得到最大吸收波長為675nm。選取同一時期不同濃度的藻液，使用血球計數板計數，測定不同濃度藻液OD675值，以OD675為縱坐標，細胞濃度為橫坐標，生成相關性曲線，并建立細胞密度與OD675之間的回歸方程。

1.2.2 培養溫度的選擇

設置5個溫度梯度，即15，18，20，22，25℃，考察不同溫度對谷皮菱形藻生長及中性脂積累的影響。取生長至對數期的藻液，接種至含D1培養基的20 mL試管中，初始接種OD675= 0.07±0.01，置于不同溫度的微電腦光照培養箱(SPX- 250B-G型，上海博訊)中靜置培養，光強為120 μmol m-2s-1，光暗比12h∶12h，每日搖動數次。每個測定設3個重復。

生長量測定方法：自接種日起，取240μL藻液加入透明的96孔酶標板中，使用酶標儀檢測藻液在OD675處的吸光值；中性脂含量測定方法[13- 14]：取240μL藻液加入黑色96孔酶標板中，加入1μL尼羅紅染液，混勻后37℃黑暗孵育10min，使用酶標儀檢測598nm激發光，543nm散發光處的熒光強度，扣除未接藻的培養基染色后的熒光強度。繪制谷皮菱形藻生長及中性脂積累變化曲線，并通過比較相對吸光值及熒光值增長量得到最佳培養溫度。之后在該溫度下，進行下一步光照強度的優化。

相對吸光值增長量=(OD675 8-OD675 1)/7

式中,OD675 8為培養第8天時藻液吸光值，OD675 1為接種時藻液吸光值。

熒光值增長量=(L8-L1)/7

式中,L8為培養第8天時藻液熒光值，L1為接種時藻液熒光值。

1.2.3 光照強度的選擇

設置3個光強梯度，120、160、200 μmol m-2s-1，考察不同光強對谷皮菱形藻生長及中性脂積累的影響。取一定量的藻液，接種至含D1培養基的20 mL試管中，初始接種OD675=0.125±0.01，置于不同光強的培養箱中培養，溫度為20℃，每個測定設3個重復。生長量與中性脂含量變化測定方法同1.2.2。選用中性脂積累量最大時的光強，進行下一步實驗。

表1 正交實驗因子的水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 N、P、Si三因素正交實驗

N源、P源、Si源分別選用NaNO3、K2HPO4與KH2PO4、Na2SiO3·9H2O。根據文獻[12- 13]并基于D1培養基配方，設計N、P、Si三因素三水平正交實驗(表1)。實驗選用L27(313)正交設計表(表2)。配制27組添加不同含量N、P、Si的培養液。取對數期的藻液，離心并用各組培養基清洗兩次，再將離心收集的材料分別接種于對應的培養基中，每組設3個平行。置于光照培養箱中培養，光強為200 μmol m-2s-1，溫度為20℃。

表2 正交實驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

測定藻株在不同培養條件下的吸光值與熒光值增長量，繪制相應曲線。吸光值增長量=(OD675 10-OD675 1)，OD675 10為培養第10天時藻液吸光值，OD675 1為接種時藻液吸光值，熒光值增長量=(L10-L1)，L8為培養第10天時藻液熒光值，L1為接種時藻液熒光值。參照相關文獻[15]對結果進行方差分析，得出谷皮菱形藻生長及中性脂積累的最優N、P、Si水平組合。

2 研究結果

2.1 OD值與細胞密度的線性關系

谷皮菱形藻藻液的波長掃描顯示(圖1)，在675nm處存在最大吸收峰。且在60s內，谷皮菱形藻沉降不明顯(圖2)，短時間內不影響吸光值的測定。谷皮菱形藻的細胞密度與光密度OD675之間，存在良好的線性關系(圖3)，相應的回歸方程為OD675=0.10179C-0.00247，線性相關系數為R2=0.99782。因此可通過測定OD675來間接表示細胞密度，進而表征藻株生長狀況。

圖1 谷皮菱形藻的光譜掃描圖

圖2 OD675隨時間的變化曲線

圖3 吸光度與細胞密度的標準曲線

2.2 不同溫度下谷皮菱形藻生長量及中性脂含量

圖4顯示了不同溫度下，谷皮菱形藻的生長情況。可以看出谷皮菱形藻在各個溫度條件下均能生長，但生長速度有一定差異。5個溫度梯度下的吸光值增長量，可以看出藻株的生長量先上升后下降，在20℃時達到最大。

圖4顯示了不同溫度下，谷皮菱形藻的熒光值變化情況。可以看出熒光值含量變化不大。5個溫度梯度下的熒光值增長量，結果顯示，藻株中性脂含量先升高后下降，在20℃下中性脂產量最大。

圖4 溫度對谷皮菱形藻生長及中性脂含量的影響

2.3 不同光照強度下谷皮菱形藻生長量及中性脂含量

圖5顯示了在120、160、200 μmol m-2s-1光強下，谷皮菱形藻的生長情況。可以看出谷皮菱形藻在不同光強下的生長趨勢相似，生長速度差異不大。3個光強梯度下的吸光值增長量，可以看出藻株在160 μmol m-2s-1時生長量達到最大。

圖5顯示了不同光強下，谷皮菱形藻的熒光值變化情況。可以看出熒光值含量隨著時間的延長而增加。3個光強梯度下的熒光值增加量，結果顯示，在200 μmol m-2s-1時中性脂產量最大。

圖5 光照強度對谷皮菱形藻生長及中性脂含量的影響

2.4 培養基N、P、Si正交實驗結果

由正交實驗結果(表2)可以看出，對于藻株吸光值增長量來說，極差RN>RP>RSi，即N含量對藻株生長影響最大，其次為P，最后是Si，對于T值來說，N2P1Si1最大，因此最佳組合為N2P1Si1，即N、P、Si濃度分別為80、120 、100 mg/L時，谷皮菱形藻生長量最大。而對于藻株熒光值增長量來說，極差值RN>RSi>RP，即N對中性脂積累影響最大，Si次之，P影響最小，根據t值可知，N2P1Si3最大，因此最佳組合為N2P1Si3，即當培養基中N、P、Si濃度分別為80、120、50 mg/L時，谷皮菱形藻的中性脂積累最多。

根據正交實驗結果，進行了方差分析，N、P、Si對谷皮菱形藻生長影響的方差分析如表3所示。由結果可知，FN、FP、FSi、FN×P、FP×Si均大于Fα，因此N、P、Si三因子以及交互作用下N×P與P×Si作用均為顯著，因子N×Si作用不顯著。各因素的最優水平為N2P1Si1，此時谷皮菱形藻生長量達到最大。表4中的結果顯示了N、P、Si對谷皮菱形藻中性脂產量影響的方差分析，FN、FSi、FN×P、FN×Si均大于Fα，因此因子N、Si及交互作用下N×P、N×Si的作用均為顯著，因子P與P×Si作用不顯著，N2P1Si3的均值最大，為最有利于中性脂積累的水平組合。

表3 正交實驗對谷皮菱形藻生長影響的方差分析Table 3 ANOVA of orthogonal experiment for effects of N, P, Si on the growth of Nitzschia palea

3 討論

谷皮菱形藻最大吸收峰的波長為675nm，藻液細胞密度不同，其色素含量也不同，因而吸光值也有差異[16]。由研究結果可知，細胞密度與光密度OD675之間，存在良好的線性關系，因此利用光密度法代替細胞計數來表征谷皮菱形藻生物量是可行的，且該方法操作步驟簡單，數據準確，有利于高通量樣品的計數。本文使用尼羅紅熒光染色法來間接表示細胞中性脂的含量，無需對樣品進行干燥、破碎，操作簡單，尤其適用于高通量樣品的測定，需要注意的是操作應在較暗環境下進行，以防熒光淬滅。

表4 N、P、Si對谷皮菱形藻中性脂產量影響的方差分析Table 4 ANOVA of orthogonal experiment for effects of N, P, Si on neutral lipid accumulation of Nitzschia palea

培養溫度的變化對藻細胞生長與脂質積累都有較大的影響。本文研究結果顯示在溫度為20℃時，最有利于谷皮菱形藻生長量與中性脂的積累，這與陳書秀等[17]的研究結果是一致的。Renaud[18]也報道過，在20℃時最適于小新月菱形藻Nitzschiaclosterium與鏟狀菱形藻N.paleacea的生長與脂質積累，這是由于溫度過高或過低都將影響藻細胞內各種酶的活性，溫度最適時，酶活性最高，此時細胞生長與脂質積累達到平衡。最佳生長和脂質積累溫度是20℃，也提示我們，在進行谷皮菱形藻大量培養時，不僅可以采用密閉式光反應器培養，也有可能在合適的季節進行室外開放式跑道池培養，以降低成本。

本文的研究結果顯示，在光強為160 μmol m-2s-1時最有利于谷皮菱形藻的生長，而中性脂積累的最佳光強要高于此值。早在1974年Orcutt就發現，高光強能促進Nitzschiacloserium細胞內甘油三酯的合成[19]，其他學者也有類似報道[20- 21]，可見適當增加光強可以有效促進中性脂的積累。有報道指出微藻中性脂大量積累一般發生于穩定期[22]，即晚于細胞增殖最快的對數期，這也提示人們在實際應用中可以采用兩步培養法，先在光強160 μmol m-2s-1下培養，以使細胞大量增殖，而后再增加光強培養，以使中性脂得到大量合成。

正交實驗的分析結果顯示，對于藻細胞生長，N元素影響最大，其次是P、Si，且N、P、Si三因子以及交互作用N×P與P×Si對藻株生長作用均為顯著，因此在藻株培養過程中，三因子都應該重點考慮。N、P、Si濃度分別為80、120、100mg/L時，生長最好。對于中性脂積累，N影響最大，其次是Si、P，且因子N、Si及交互作用N×P、N×Si作用均為顯著，因此基于中性脂積累的藻株培養中，N、Si應優先考慮。N、P、Si的含量分別為80、120、50 mg/L時，最利于藻細胞中性脂積累。N缺乏與Si缺乏在一定程度上可以增大中性脂的積累，可能是因為氮素的缺乏導致蛋白質合成的減少，從而使代謝途徑朝脂肪和碳水化合物方向發展，而Si的缺乏被認為是促使某種合成脂質的酶活性增強，導致脂質含量增加[23]。這也再次提示我們，在采用兩步培養時，可以先以細胞增殖為目的，而后再降低Si濃度，以增加脂質合成。

4 結論

(1)谷皮菱形藻在675nm時，細胞密度與光密度OD675之間，存在良好的線性關系，利用光密度法表征谷皮菱形藻生物量步驟簡單，數據準確，有利于高通量樣品的計數。采用尼羅紅熒光染色法間接表示細胞中性脂的含量，無需對樣品進行干燥、破碎，操作簡單，適用于高通量樣品的測定。

(2)谷皮菱形藻在20℃，光強160 μmol m-2s-1時生長最快，在20℃，光強200 μmol m-2s-1時，最有利于脂質積累。

(3)培養基中N、P、Si濃度分別為80、120、100 mg/L時，有利于谷皮菱形藻細胞生長，其中，N元素影響最大，其次是P、Si，且N、P、Si三因子以及交互作用N×P與P×Si對藻株生長作用均為顯著。培養基中N、P、Si濃度分別為80、120、50 mg/L時，利于中性脂積累，其中，N元素影響最大，其次是Si、P，且因子N、Si及交互作用N×P、N×Si作用均為顯著。

(4)可采用兩步培養法，先使谷皮菱形藻細胞大量增殖，而后適當改變培養條件，以增加脂質合成。

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Effects of physical and chemical factors on the growth and neutral lipid content ofNitzschiapalea

BAN Jianjiao, FENG Jia, WANG Zhiqiang, XIE Shulian*

SchoolofLifeScience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China

An algal strain,NitzschiapaleaNY025, was chosen as experimental materials for its high-lipid content. The feasibility of optical density method used for cell growth determination was investigated first. Then Nile red fluorescence was used for determining the relative neutral lipid contents because neutral lipid content was a key standard of choosing algae in biodiesel production. Furthermore, the effects of temperature, light intensity, nitrogen, phosphorus and silicon on the cell growth and neutral lipid contents ofN.paleawere investigated. The results showed that: (1) The maximum absorption ofN.paleaexisted at 675nm, and the absorption showed a good linear relationship with cell density. Therefore, the growth ofN.paleacould be obtained by measuring OD675. Optical density method and Nile red fluorescence possessed advantage of simple operation, so they were suitable for high-throughput sample analysis. (2) The optimum temperature was 20℃ for increasing the cell density and neutral lipid content ofN.palea. The finest light intensity for the growth ofN.paleawas 160 μmol m-2s-1, while the best light intensity for neutral lipid accumulation was 200 μmol m-2s-1. It is suggested that increasing light intensity appropriately might increase neutral lipid contents in algal cells. (3) Under the optimum temperature and light intensity, the orthogonal experiments of nitrogen, phosphorus and silicon were designed to research into their effects on the growth and neutral lipid contents ofN.palea. The influence of nitrogen on the growth ofN.paleawas the most significant, then the factor phosphorus and the last one was factor silicon. The growth ofN.paleawas influenced significantly by factors nitrogen, phosphorus, silicon and interaction factors nitrogen with phosphorus, nitrogen with silicon. The optimum growth rate was obtained when the content of nitrogen, phosphorus and silicon were 80 mg/L, 120 mg/L and 100 mg/L, respectively. The influence of factor nitrogen on neutral lipid accumulation was the most significant, next was factor silicon and the last one was factor phosphorus. Neutral lipids accumulation was influenced significantly by factors nitrogen, silicon and interaction factors nitrogen with phosphorus, nitrogen with silicon. The maximum neutral lipid accumulation was obtained when the concentration of nitrogen, phosphorus and silicon were 80 mg/L, 120 mg/L and 50 mg/L, respectively. (4) In conclusion, the lipid synthesis can be improved by two-step method. First the cell density ofN.Paleawas increased, and after gathering plenty of cells the culture conditions changed to increase neutral lipid contents.

Nitzschiapalea; physical and chemical factors; cells density; neutral lipid

2013- 06- 21;

2014- 05- 30

10.5846/stxb201306211754

*通訊作者Corresponding author.E-mail: xiesl@sxu.edu.cn

班劍嬌, 馮佳, 王志強, 謝樹蓮.理化因子對谷皮菱形藻細胞密度及中性脂含量的影響.生態學報,2015,35(10):3349- 3356.

Ban J J, Feng J, Wang Z Q, Xie S L.Effects of physical and chemical factors on the growth and neutral lipid content ofNitzschiapalea.Acta Ecologica Sinica,2015,35(10):3349- 3356.