降尿酸藥物篩選方法學研究進展

張 雪，俸婷婷，黃俊飛，喬 楊，周 英*

(1.貴州大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中藥民族藥創制工程中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州省藥食同源植物資源研究開發中心，貴州 貴陽 550025)

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降尿酸藥物篩選方法學研究進展

張 雪1,2,3，俸婷婷1,2,3，黃俊飛1,2,3，喬 楊1,2,3，周 英1,2,3*

(1.貴州大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省中藥民族藥創制工程中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州省藥食同源植物資源研究開發中心，貴州 貴陽 550025)

降尿酸藥物的篩選方法分為體內和體外篩選兩種。體內篩選方法是建立高尿酸血癥動物模型，體外篩選方法是建立腎小管上皮細胞模型和體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑。目前體內動物模型篩選方法研究比較成熟，已有諸多文獻報道，體外酶抑制劑和細胞水平篩選尚需進一步探索研究。總結降尿酸藥物體內外篩選方法，為新藥開發利用提供參考依據。

降尿酸藥物；高尿酸血癥；腎小管上皮細胞；黃嘌呤氧化酶

尿酸是人體內嘌呤代謝的終產物。人體內80%尿酸是在體內合成，或由次黃嘌呤、黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶(XO)的作用下分解代謝產生，20%尿酸由攝入食物中的核蛋白或嘌呤分解代謝產生。尿酸主要經腎臟排泄，以原形經腎小球濾過進入腎小管，經過腎小管重吸收和再分泌，最后進入集合管，經泌尿系統排出體外。當嘌呤代謝異常或腎小管對尿酸的重吸收增加時，人體內的尿酸總量會升高，引發一系列病癥。

人體內血尿酸含量正常值為1 200mg，當血尿酸含量超過正常范圍時，易導致高尿酸血癥，損害腎臟功能；當血尿酸濃度過高時，易在關節部位形成結晶沉淀，導致關節腫脹和疼痛而引發痛風。此外，高尿酸血癥與血糖、血脂代謝密切相關，是引發動脈粥樣硬化、冠心病和高血壓的危險因素，是冠心病患者死亡的獨立預警因子，在糖尿病及其并發癥發生和發展中起到重要作用[1]。

根據尿酸產生與排泄的機制，降尿酸的途徑主要包括減少尿酸生成、增加尿酸排泄、抑制尿酸重吸收。降尿酸藥物可通過建立高尿酸血癥動物模型進行體內篩選，或建立腎小管上皮細胞(RTEC)模型進行體外篩選，還可直接在體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑。本文主要對降尿酸藥物的體內和體外篩選方法進行綜述，為治痛風新藥的研發提供參考依據。

1 降尿酸藥物體內篩選方法

降尿酸藥物的體內篩選方法為建立高尿酸血癥動物模型，造模方法主要分為以下三種[2]：①直接攝入尿酸、高嘌呤食物或尿酸前體物質，增加黃嘌呤氧化酶活性，促進尿酸產生，形成高尿酸血癥模型；②通過給藥抑制尿酸排泄，增加血尿酸濃度，形成高尿酸血癥，常用藥物為腺嘌呤、煙酸等；③抑制尿酸酶活性。尿酸酶可氧化分解成尿酸，通過抑制或消除尿酸酶活性可增加血尿酸濃度，常用尿酸酶抑制劑為氧嗪酸。此外，還可利用基因工程技術，破壞小鼠尿酸酶基因，獲得尿酸酶缺乏的突變型小鼠高尿酸血癥模型[3]。

高尿酸血癥通常會伴有其他合并癥，引發一系列繼發性損傷，如糖脂代謝紊亂、痛風、腎損傷及心血管疾病。因此，高尿酸血癥動物模型可分為單純性高尿酸血癥模型和伴繼發性損傷或合并癥的高尿酸血癥模型。

1.1 單純性高尿酸血癥動物模型

單純性高尿酸血癥常用造模動物為大鼠、小鼠。楊桂梅等[4]灌胃給予大鼠氧嗪酸，大鼠體內尿酸含量明顯升高，且維持時間較長，無腎功能損害。張培等[5]灌胃給予大鼠高酵母飼料及腺嘌呤溶液，皮下注射氧嗪酸乳懸液，獲得慢性高尿酸血癥模型，該模型穩定、血尿酸含量高、維持時間長。董靜[6]連續灌胃給予小鼠酵母膏和乙胺丁醇3周，獲得持久穩定的高尿酸血癥模型。

1.2 伴繼發性損傷或合并癥的高尿酸血癥動物模型

伴繼發性損傷或合并癥的高尿酸血癥模型常用動物為大鼠、小鼠、雞及鵪鶉。Stavric等[7]以氧嗪酸、尿酸混合飼料喂養大鼠，使其血尿酸含量升高，腎臟內出現明顯的尿酸鹽結晶沉積、腎小管間質纖維化及尿酸性梗阻型腎病。迪麗達爾·希力甫等[8]腹腔注射給予大鼠酵母膏和氧嗪酸，使其尿酸維持高濃度水平，且大鼠腎臟、心臟及動脈發生形態和病理改變，是研究高尿酸血癥引起繼發性心血管病理損傷的良好模型。高碧珍等[9]以高糖、高脂飼料飼養大鼠，以腺嘌呤灌胃，可復制高尿酸血癥合并糖脂代謝紊亂模型。 匡紅艷[10]采用高蛋白質、高鈣飼料飼喂雞并限水，雞的跗踝周徑明顯增大，獲得高尿酸痛風性關節炎動物模型。楊紅蓮等[11]采用尿酸、腺素混合飼料喂飼鵪鶉，獲得持續穩定的高尿酸血癥模型，隨著造模時間的延長，鵪鶉還伴發有糖、脂代謝紊亂，肝、腎功能損傷等病理表現。

2 降尿酸藥物體外篩選方法

降尿酸藥物的體外篩選方法為建立腎小管上皮細胞模型，還可直接在體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑。尿酸進入腎臟后，經腎小管上皮細胞頂模進入上皮細胞，再經細胞的基底膜進入腎小管周圍的毛細血管，進而回到體液中，當尿酸重吸收量增大時，血漿中尿酸濃度便會升高。因此，通過建立腎小管上皮細胞(RTEC)模型，考察體外測定藥物對RTEC尿酸重吸收功能的影響，可篩選出降尿酸藥物。黃嘌呤氧化酶(XO)在尿酸生成過程中具有重要作用，其可催化次黃嘌呤生成黃嘌呤，進而生成尿酸，XO還可直接催化黃嘌呤生成尿酸。因此，可在體外測定藥物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用，篩選降尿酸藥物。

2.1 腎小管上皮細胞模型

RTEC模型的建立可分為原代分離培養和細胞株培養兩種，各有優缺點。原代分離的RTEC形態和特征保留完整，生物性狀變化不大，更接近體內狀態，具有較好的特異性，且其分化程度高，穩定性強，是體外研究RTEC對尿酸吸收功能的最佳選擇。但原代分離的RTEC中雜細胞多，細胞純度不高，且原代分離的RTEC高度分化，僅能傳2～3代，需重復分離。細胞株的培養可無限增殖和傳代，但功能特征與體內原始狀態差異較大，其尿酸吸收功能有一定改變，在篩選降尿酸藥物時具有一定的限制性。原代分離RTEC的介質主要為人、大鼠、小鼠和兔腎臟，通過酶消化法獲取腎小管節段進行組織培養，進而獲取RTEC。腎小管節段的純化可采用細胞篩機械分離，或者percoll分離液梯度離心分離，也可兩者聯用。

臧路平等[12]取小鼠腎臟，切取腎皮質剪碎研磨，采用Ⅰ型膠原酶消化，依次過50目、100目篩網，Per coll密度梯度離心分離腎小管節段進行培養，獲得小鼠RTEC。然后采用分離的細胞進行尿酸吸收功能測試，驗證了該模型可用于體外篩選降尿酸藥物。嚴玉澄[13]取正常人腎皮質的組織塊，采用無血清培養液直接培養，獲得了人近端腎小管上皮細胞。

RTEC可自發性或誘發性轉變為永生化細胞株，使用SV40病毒可有效誘導RTEC無限增殖[14]。目前實驗室已獲得了高度專一的腎小管上皮細胞株，包括近曲腎小管細胞、髓袢升支細胞等[15]。

2.2 黃嘌呤氧化酶抑制劑篩選

XO可催化次黃嘌呤和黃嘌呤氧化生成尿酸，并產生氧自由基，因此抑制XO活性即可達到降尿酸效果。在體外測定藥物對XO活性的影響，即可篩選XO抑制劑。XO活性的測定方法主要為紫外分光光度法，吸光度值越大，XO活性越高。此外，也可在反應體系中加入氯化硝基四氮唑藍(NBT)，NBT可與氧自由基產生紫色的甲臜，通過測定甲臜的吸光度可反映XO的活性。體外篩選XO抑制劑時，需考慮待測樣品的吸光度干擾，設置空白對照實驗。

朱深銀等[16]建立了XO抑制劑的高通量篩選模型，并篩選了71 760個化合物和初提物。黎莉等[17]利用體外XO抑制劑篩選方法，發現枳椇子乙醇提取物、高良姜乙醇提取物和葛花乙酸乙酯提取物對XO具有較強的抑制活性。

3 結語

尿酸水平升高可引發痛風、腎功能損傷、心血管疾病及代謝綜合征等。隨著生活水平的提高，高尿酸血癥的發病率呈上升趨勢，因此篩選降尿酸藥物對高尿酸血癥的防治至關重要。

降尿酸藥物的篩選分為體內和體外兩種。體內篩選是建立高尿酸血癥動物模型，給藥后進一步篩選出具有降尿酸作用的藥物。體外篩選是建立腎小管上皮細胞模型和體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑。腎小管上皮細胞模型的建立可選擇原代分離和細胞株培養，該模型藥物作用靶點精準，數據直觀。黃嘌呤氧化酶抑制劑的體外篩選具有效率高、靈敏性好、作用準確等優點。

與體內篩選方法相比，降尿酸藥物的體外篩選具有明顯的局限性，不能充分反映藥物的藥理作用以及機體對藥物的吸收代謝過程。但體外篩選方法可在細胞和分子水平上進行降尿酸藥物的篩選，具有高效、靈敏、準確、經濟等特點，特別適合高通量藥物的篩選。隨著體外篩選模型評價標準的發展以及新藥作用靶點的研究發掘，篩選模型將更加具有新穎性和實用性，將成為新藥開發的一個重要研究方向。

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(責任編輯：尹晨茹)

2014-11-26

貴州大學引進人才科研項目(貴大人基合字(2012)010號)；貴州省國際科技合作計劃項目(黔科合外G字[2013]7009號)；貴州省科學技術基金項目(黔科合J字[2012]2173號)；貴陽市科技計劃項目2012現代藥業計劃(筑科合同[2012204]9號)；貴州省藥食同源植物資源研究開發中心(黔科合G字[2014]4003號)；貴州大學研究生創新基金(研農2015020)

張雪(1990-)，女，貴州大學碩士研究生，研究方向為天然藥物活性成分及藥理作用。

周英(1971-)，女，博士，貴州大學教授，博士生導師，研究方向為中藥新藥研發。

R965.1

A

1673-2197(2015)06-0048-02

10.11954/ytctyy.201506021