TLR4在慢性支氣管炎大鼠氣道粘液高分泌中的作用及多粘菌素B干預的影響＊

萬寧 張建勇 唐鳳鳴 李永春 張健 陳德

（1.宜賓市第一人民醫院呼吸內科，四川 宜賓 644000；2.遵義醫學院附屬醫院呼吸二科，貴州 遵義 563000）

氣道粘液高分泌是慢性氣道疾病的重要特征，氣道粘液高分泌的確切發生機制及其調控目前尚不十分清楚。氣道粘液高分泌的分子基礎是氣道主要粘蛋白（Muc）5AC的產生和分泌增加［1］，而細菌感染是慢性氣道疾病發生發展或反復加重的重要因素，其中G－菌是其最主要的致病菌之一，而脂多糖（LPS）則是G－菌感染的主要致病因子。本實驗探討Toll樣受體4（TLR4）信號轉導通路在細菌LPS誘導大鼠慢性支氣管炎氣道粘蛋白表達中的作用，將有助于闡明G－菌感染引起氣道粘液高分泌發生的分子機制，對慢性氣道疾病氣道粘液高分泌的防治可能有重要意義，并可能為氣道粘液高分泌的藥物干預治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 慢性支氣管炎模型建立與分組 SPF 級6～8周齡雄性Wistar大鼠40只（購自重慶第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心），體重220～240g，隨機分為正常對照組（NS組）、慢性支氣管炎組（LPS組）、多粘菌素B（PMB）干預組（LPS＋PMB 組）和多粘菌素B自身對照組（PMB組）各10只。參考Nie YC 等［2］方法并作改進，建立大鼠慢性支氣管炎模型：第1 天氣管內注入脂多糖（LPS）200μg／200μl（E.coli 055：B5，美國Sigma 公司）后，每天在自制玻璃箱（50cm×50cm×40cm）內霧化吸入（德國百瑞壓縮吸入器，型號：085G1005）LPS溶液（50μg／ml）1小時，連續3周。NS組用NS代替LPS；LPS＋P MB 組除建立大鼠慢性支氣管炎模型外，于每日霧化吸入前1小時給予腹腔注射PMB（美國Amresco）1mg／kg干預；PMB 組除同NS組外，于每日霧化吸入前1小時給予腹腔注射PMB 1mg／kg。

1.2 肺組織標本和支氣管肺泡灌洗液制備 大鼠持續霧化吸入3 周后處死，取右上、中葉肺組織迅速放入－80℃冰箱保存，以備RNA 提取。取右下葉肺組織放入4%多聚甲醛中固定。左肺行支氣管肺泡灌洗［3］獲得支氣管肺泡灌洗液（BALF）做細胞計數、白細胞分類和腫瘤壞死因子－α（TNF－α）測定。

1.3 ELISA 測 定BALF 細胞因子TNF－α 采 用ELISA 雙抗體夾心法，按試劑盒（上海森雄科技實業有限公司）說明書檢測BALF中TNF－α含量，酶標儀（ELX800，美國）在492nm 處測吸光度。所有光密度（OD）值都減除空白值后再行計算，以標準品之OD 值在半對數紙上作圖，畫出標準曲線，根據樣品OD 值在該曲線上查出相應的含量。

1.4 AB－PAS染色 肺組織石蠟切片，常規脫蠟至水，做阿先藍－過碘酸雪夫（AB－PAS）染色，進行圖片采集和相對著色面積的定量分析。

1.5 免疫組化法檢測氣道Muc5AC 和肺組織TLR4的表達 均采用二步法，Muc5AC 一抗為小鼠抗Muc5AC單克隆抗體（SANTA 公司），鼠抗－Muc5AC抗體二步法試劑盒（北京中杉金橋生物公司）。TLR4一抗為羊抗大鼠TLR4多克隆抗體（美國Santa Crue公司），羊抗－TLR4抗體二步法試劑盒（北京中杉金橋生物公司）。均按試劑盒說明進行操作，以積分光密度（IOD）為指標進行定量分析。

1.6 熒光定量RT－PCR 檢測肺組 織Muc5AC 和TLR4 mRNA 表達 采用RNAiso Reagent 試劑（TaKaRa公司）說明書提取各組大鼠肺組織總RNA，取0.5μg RNA 逆轉錄（逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，DRR037S），按試劑盒說明書合成cDNA。Muc5AC、TLR4及內參照β－actin 的引物由TaKaRa公司設計合成，其序列見表1。按PCR 反應試劑盒（TaKaRa 公 司，DRR041S）說明書進 行PCR 反 應（ICycler iQ 熒光定量PCR 儀，美國BIO－RAD 公司），反應條件為：95℃10s，95℃5s，62℃20s，共40個循環。每一例樣本反應結束后由計算機自動計算并讀出定量結果Ct值（threshold cycle）。

表1 Muc5AC、TLR4、β－actin引物序列Table 1 Primer sequence of Muc5AC，TLR4，β－actin

1.7 統計學分析 熒光定量RT－PCR 獲取的Ct值采用2－△△Ct法進行相對定量，實驗數據用表示，采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，組間均數比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果 NS組和PMB 組大鼠支氣管管壁及其周圍組織結構完整而清晰，未見或偶見很少量炎性細胞。LPS組見支氣管上皮細胞損傷脫落，杯狀細胞明顯增多，支氣管壁及其周圍組織和肺泡以中性粒細胞和巨噬細胞為主的大量炎性細胞浸潤，炎癥細胞浸潤明顯處可見管壁平滑肌束斷裂，排列紊亂，管腔狹窄。與LPS 組比較，LPS＋PMB 組大鼠上述病變明顯減輕。

2.2 BALF 細胞計數和白細胞分類 NS組和PMB組大鼠BALF中白細胞總數和細胞分類差異無顯著性（P＞0.05），主要以巨噬細胞為主；LPS組BALF中白細胞總數、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞均較NS組明顯增多，差異有顯著性（均P＜0.01）；LPS＋PMB組BALF中細胞總數、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞與LPS組比較明顯減少（均P＜0.01），而較NS組有所增加。

2.3 BALF 細胞因子TNF－α 水平測定 NS 組 和PMB組BALF 中TNF－α 水平差異無顯著性（P＞0.05）；LPS組、LPS＋PMB 組BALF 中TNF－α水平較NS組明顯增高，差異有顯著性（P＜0.01）；LPS＋PMB組增高值較LPS 組低，差異亦有顯著性（P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠BALF中TNF－α的變化（）Table 2 The levels of TNF－αin BALF

表2 各組大鼠BALF中TNF－α的變化（）Table 2 The levels of TNF－αin BALF

注：與NS組比較，①P＜0.01；與LPS組比較，②P＜0.01

2.4 氣道AB－PAS染色 NS組和PMB組氣道粘液物質染色差異無顯著性（P＞0.05）；LPS 組、LPS＋PMB組氣道粘液物質相對著色面積較NS組明顯增高，差異有顯著性（P＜0.01）；LPS＋PMB組增高值較LPS組低，差異亦有顯著性（P＜0.01）。

2.5 氣道Muc5AC和肺組織TLR4表達水平測定Muc5AC表達于支氣管管腔內，其余肺組織未見表達。NS組和PMB組Muc5AC表達低，且二者間差異無顯著性（P＞0.05）；LPS 組可見大量Muc5AC 表達，其IOD 值明顯高于NS 組，差異有顯著性（P＜0.01）；LPS＋PMB組Muc5AC表達量較LPS組明顯減低，但仍高于NS 組，差異亦有顯著性（均P ＜0.01），見表3、圖1～4。TLR4主要表達于支氣管上皮、肺泡、血管壁等，均為膜表達。TLR4在NS組和PMB組表達均低，差異無顯著性（P＞0.05）；LPS組可見大量TLR4表達，其IOD 值明顯高于NS組，組間差異有顯著性（P＜0.01）；LPS＋PMB 組表達量較LPS組明顯減低（P＜0.01），但仍高于NS 組（P＜0.05），見表3、圖5～8。

表3 各組大鼠氣道Muc5AC和肺組織TLR4的表達（）Table 3 The expressions of Muc5AC and TLR4in lung tissue of rats

表3 各組大鼠氣道Muc5AC和肺組織TLR4的表達（）Table 3 The expressions of Muc5AC and TLR4in lung tissue of rats

注：與NS組比較，①P＜0.01；與LPS組比較，②P＜0.01

2.6 肺組織Muc5AC 和TLR4 mRNA 表達水平測定 NS 組和PMB 組大鼠氣道粘蛋白Muc5AC mRNA表達量低，且二者間差異無顯著性（P＞0.05）；LPS組較NS 組表達明顯增高，差異有顯著性（P＜0.05），LPS＋PMB 組表達量亦增高，但低于LPS 組（P＜0.05）。TLR4mRNA 在NS 組 和PMB 組大鼠肺組織表達量低，但二者間差異無顯著性（P＞0.05）；LPS組較NS組明顯增高，差異有顯著性（P＜0.05）；LPS＋PMB 組表達量亦增高，但低于LPS 組（P＜0.05），見表4。

表4 大鼠肺組織Muc5AC和TLR4mRNA表達（）Table 4 The mRNA expressions of Muc5AC and TLR4in lung tissue of rats

表4 大鼠肺組織Muc5AC和TLR4mRNA表達（）Table 4 The mRNA expressions of Muc5AC and TLR4in lung tissue of rats

注：與NS組比較，①P＜0.05；與LPS組比較，②P＜0.05

圖1 NS組氣道Muc5AC表達（IHC×200）Figure 1 The expression of Muc5AC in NS group

圖2 LPS組氣道Muc5AC表達（IHC×200）Figure 2 The expression of Muc5AC in LPS group

圖3 LPS＋PMB組氣道Muc5AC表達（IHC×200）Figure 3 The expression of Muc5AC in LPS＋PMB group

圖4 PMB組氣道Muc5AC表達（IHC×200）Figure 4 The expression of Muc5AC in PMB group

圖5 NS組肺TLR4表達（IHC×400）Figure 5 The expression of TLR4in NS group

圖6 LPS組肺TLR4表達（IHC×400）Figure 6 The expression of TLR4in LPS group

圖7 LPS＋PMB組肺TLR4表達（IHC×400）Figure 7 The expression of TLR4in LPS＋PMB group

圖8 PMB組肺TLR4表達（IHC×400）Figure 8 The expression of TLR4in PMB group

3 討論

目前認為氣道粘液高分泌已成為影響慢性氣道疾病，如慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘及囊性纖維化等病情和預后的獨立危險因素［4］。粘蛋白是氣道粘液的最主要成分。以往的研究顯示，病理情況下氣道Muc以Muc5AC占優勢，故氣道上皮Muc5AC 的含量和Muc5AC的轉錄水平代表氣道粘液產生分泌的強度［5］。

TLR 為一類被某些內源性分子和微生物保守性分子成分所激活的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），因其胞外段與果蠅蛋白Toll同源而得名，在免疫應答和炎性反應中發揮重要作用。目前已發現的TLR 家族蛋白有10 種，分別命名為TLR1～10，TLR4是G－菌LPS的主要受體［6］。研究表明，人類氣道上皮細胞存在TLR，其中TLR4主要分布于細胞基底膜［7］。在LPS刺激下，可使TLR 激活并通過TLRs信號通路介導多種生物學效應［8］。

細菌感染是氣道炎癥反應和粘液高分泌發生發展的重要因素，G－菌是呼吸道感染最重要的致病菌，LPS是決定G－細菌致病力的關鍵毒素。在LPS刺激下，氣道上皮細胞的TLR 水平升高，Xu Y 等［9］用RT－PCR 及免疫組化證實，主要是TLR4上調。Pera T 等［10］發現，LPS可誘使豚鼠氣道上皮粘蛋白分泌增多和杯狀細胞化生。本研究中我們使用大腸桿菌LPS，向SPF級大鼠氣管內一次注入LPS和持續LPS霧化吸入3周，成功建立了LPS致大鼠慢性支氣管炎和氣道粘液高分泌模型。結果顯示，LPS組病理學改變為支氣管上皮細胞損傷脫落，杯狀細胞明顯增多，支氣管壁及其周圍組織和肺泡有以中性粒細胞和巨噬細胞為主的大量炎性細胞浸潤，可見管壁平滑肌束斷裂，排列紊亂，管腔狹窄。LPS組BALF 中白細胞總數、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、TNF－α水平均較NS組明顯增多。LPS組在AB－PAS氣道粘液物質相對著色面積和免疫組化檢測肺組織Muc5AC、TLR4 的IOD 值均較NS 組明顯增 高。LPS 組Muc5AC mRNA、TLR4mRNA 表達均較NS 組明顯增高。

PMB是一種陽離子性環狀10縮氨酸結構，是由多粘桿菌產生的一組化學上相關的脂酰基縮氨酸抗生素的總稱。這種兩性分子試劑含有疏脂和親脂性集團，一個多肽尾（以脂肪酸終止），與LPS的脂質A部分具有高度的親和力，能吸附除去介質中的LPS，并能破壞G－菌外層或細胞質膜的通透性，具有抗菌和滅活LPS的作用，使LPS介導的信號轉導通路中斷。本研究結果顯示，LPS＋PMB 組病理學改變較LPS組明顯減輕，在BALF中白細胞總數及其細胞分類、TNF－α水平均較LPS組明顯減少，但高于NS組。且其AB－PAS氣道粘液物質相對著色面積和免疫組化檢測肺組織Muc5AC、TLR4的IOD 值均較LPS組明顯減低，但仍高于NS 組。同時LPS＋PMB 組Muc5AC mRNA、TLR4mRNA 表達量增高，但均低于LPS組，與國外學者研究結果一致。

4 結論

通過本研究結果可以推測，TLR4信號通路介導的細菌LPS作用與氣道粘蛋白Muc5AC 的產生及其高表達之間可能存在必然聯系。PMB通過對抗LPS，可能抑制氣道Muc5AC、TLR4蛋白及Muc5ACmRNA、TLR4mRNA 表達。

［1］Ryan A，Smith A，Moore P，et al.Expression and Characterization of a Novel Recombinant Version of the Secreted Human Mucin MUC5AC inAirway Cell Lines［J］.Biochemistry，2015，54（4）：1089－1099.

［2］Nie YC，Wu H，Li PB，et al.Characteristic comparison of three rat models induced by cigarette smoke or combined with LPS：to establish a suitable model for study of airway mucus hypersecretion in chronic obstructive pulmonary disease［J］.Pulm Pharmacol Ther，2012，25（5）：349－356.

［3］Mizuguchi Y，Myojo T，Oyabu T，et al.Comparison of doseresponse relations between 4－week inhalation and intratracheal instillation of NiO nanoparticles using polimorphonuclear neutrophils in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker of pulmonary nflammation［J］.Inhal Toxicol，2013，5（1）：29－36.

［4］Rubin BK.Secretion properties，clearance，and therapy in airway disease［J］.Transl Respir Med，2014，10（3）：2－6.

［5］Xu R，Li Q，Zhou X，et al.Annexin II mediates the neutrophil elastase－stimulated exocytosis of mucin 5ac［J］.Mol Med Rep，2014，9（1）：299－304.

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［7］Yin Y，Hou G，LiER，et al.Regulation of cigarette smoke－induced toll－like receptor 4expression by peroxisome proliferatoractivated receptor－gamma agonists in bronchial epithelial cells［J］.Respirology.2013，18（3）：30－39.

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［9］Xu Y，Zhang Y，Cardell LO.Nicotine exaggerates LPS－induced airway hyperreactivity via JNK－mediated up－regulation of Toll－like receptor 4［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2014，51（3）：370－379.

［10］Pera T，Zuidhof AB，Smit M，et al.Arginase inhibition prevents inflammation and remodeling in a guinea pig model of chronic obstructive pulmonary disease［J］.J Pharmacol Exp Ther，2014，349（2）：229－238.