瑞舒伐他汀對支氣管哮喘患者Th2免疫異常的調控作用＊

朱濤 葉春燕 文富強 張維

（1.四川大學華西醫院呼吸病學研究室／呼吸內科，成都，四川，610041；2.成都市金牛區人民醫院；3.成都醫學院第一附屬醫院呼吸內科，成都，四川，610000）

支氣管哮喘（bronchial asthma，簡稱哮喘），是一種由多種細胞及細胞組分參與的非特異性氣道炎癥性疾病［1－6］。流行病學調查發現目前全球哮喘患者接近3億人，且哮喘的發病率存在上升趨勢［1－6］。近年的研究均提示Th1／Th2免疫應答失衡在哮喘的發病過程中扮演著重要的角色［7－9］。研究發現糾正Th1／Th2免疫應答失衡對哮喘的炎癥水平及肺功能有改善作用［10－12］。他汀類藥物對哮喘相關的氣道炎癥作用有顯著的抑制作用，并認為該作用可能與調節Th1／Th2免疫應答失衡密切相關［13，14］。本研究的目的是探討瑞舒伐他汀輔助治療對于成年支氣管哮喘患者Th1／Th2免疫應答失衡、炎癥水平和肺功能的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本試驗采用單盲、雙模擬、單中心、隨機陽性對照方法進行。按照診斷標準［15］，將我院2011年3月至2014年10月初次診斷的100例成年的中到重度成年哮喘患者，隨機平均分為治療組和對照組（n＝50）。治療組男29例，女21例，年齡（48.2±16.5）歲。對照組，男31 例，女19 例，年 齡（50.6±17.4）歲。哮喘病史皆大于5年。兩組患者在年齡、病程和病情等方面比較差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。同時患者均被詳細告知實驗內容和實驗方法及存在的潛在不良反應，并簽字同意。

1.2 排除標準 排除標準包括：實驗前6 個月因急性加重住院治療；實驗前4周有除哮喘外的其他呼吸系統疾病或下呼吸道感染；實驗前6 個月仍吸煙，或雖已戒煙但有10年以上吸煙史；有其他變應性鼻炎、寄生蟲感染、嗜酸細胞浸潤性支氣管炎和嗜酸細胞增多癥等血中可檢出嗜酸性粒細胞增高的其他疾病；嚴重的心、肝、腎功能不全；難以控制的高血壓；Ⅰ型糖尿病；活動性肺結核；惡性腫瘤等其他嚴重疾病；妊娠狀態或哺乳期婦女；不愿參加者。

1.3 治療方法 在患者哮喘教育、環境控制和按需使用沙丁胺醇吸入劑緩解癥狀的基礎上，給予布地奈德福莫特羅粉吸人劑（信必可都保，阿斯利康公司），（160μg／4.5μg）／吸，2吸／天的導入期（run－in period）治療14天后。對照組使用布地奈德福莫特羅粉吸人劑（160μg／4.5μg）／吸，2吸／天，并給予安慰劑。試驗組使用布地奈德福莫特羅粉吸人劑（160μg／4.5μg）／吸，2吸／天的基礎上加用瑞舒伐他汀鈣片（阿斯利康公司），20mg／天進行治療。干預時間為13 周。沙丁胺醇為唯一急救藥物。在該臨床研究過程中未見與治療藥物相關的嚴重的不良反應發生。

1.4 肺功能檢測 兩組均于治療前及治療13 周后進行肺功能測定。吸入200μg沙丁胺醇15min后測定FEV1占預計值%和PEF個人最佳值%。

1.5 血中IL－4、IL－5和IL－13水平檢查 取患者于治療前與治療13周后清晨空腹靜脈血。根據ELISA 試劑盒（R＆D Systems，USA）說明書方法，對血中IL－4、IL－5和IL－13水平進行檢測。

1.6 血細胞中GATA－3 mRNA 表達分析 在治療前和治療13 周后，按照試劑盒說明書提取血細胞的總RNA，反轉錄為cDNA，并以cDNA 為模板進行PCR 反 應。GATA－3 正 義5′－ACTAC GGAAACT CGGTCAGG－3′，反 義5′－CAGGGT AGGGA TCCATGAAG－3′；β－actin正義：5′－ACTTAGTTG CGTTA CACC CTT－3′，反義：5′－GTCAC CTTCACC GTTCCA－3′。使用β－actin作為內參基因，使用2－△△CT公式計算目的基因相對表達量。ΔΔCt＝（Ct，目標－Ct，β－actin）干預組－（Ct，目標－Ct，β－actin）對照組。

1.7 血細胞中T－bet和GATA－3蛋白表達分析 對患者治療前和治療13周后血細胞中GATA－3蛋白的表達水平使用western blot法進行檢測。按照試劑盒操作要求，首先提取血液中總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1h，分別加入GATA－3 抗體（1∶800）和β－actin 抗體（1∶1200），4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2000），用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描。

1.8 統計分析 應用SPSS 17.0軟件進行分析，計算數據使用（）表示，組間比較采用t檢驗分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FEV1占預計值和PEF 個人最佳值 經13周治療后兩組患者FEV1占預計值和PEF 個人最佳值較治療前均有明顯改善，差異有統計學意義（P 均＜0.05）；且干預組較對照組改善更加顯著，差異有統計學意義（P 均＜0.05），見表1。

2.2 血中IL－4、IL－5 和IL－13 水平測定 通過治療13周后，2組患者血中IL－4、IL－5和IL－13水平均較治療前明顯下降，差異有統計學意義（P 均＜0.05）；且干預組患者下降更加明顯，差異有統計學差異（P均＜0.05），見表2。

表1 FEV1占預計值%和PEF個人最佳值%比較（，n＝50）Table 1 FEV1%and PEF%in the two group

表1 FEV1占預計值%和PEF個人最佳值%比較（，n＝50）Table 1 FEV1%and PEF%in the two group

注：治療前比較①P＜0.05；與對照組對應時間點比較②P＜0.05。

表2 血中IL－4、IL－5和IL－13水平（，n＝50）Table 2 The serum levels of IL－4，IL－5and IL－13in the two groups

表2 血中IL－4、IL－5和IL－13水平（，n＝50）Table 2 The serum levels of IL－4，IL－5and IL－13in the two groups

注：與治療前比較①P＜0.05；與對照組對應時間點比較②P＜0.05。

2.3 血細胞中GATA－3的表達水平 通過治療13周后，2組患者血細胞中GATA－3mRNA 和蛋白的表達較治療前顯著降低，差異均有顯著統計學意義（P均＜0.05）。同時，干預組各指標較對照組改善更加明顯，差異有顯著統計學意義（P 均＜005）。見表3，圖1。

表3 血細胞中T－bet和GATA－3mRNA和蛋白的表達水平（，n＝50）Table 3 The mRNA and protein expression of T－bet and GATA－3in blood cells

表3 血細胞中T－bet和GATA－3mRNA和蛋白的表達水平（，n＝50）Table 3 The mRNA and protein expression of T－bet and GATA－3in blood cells

注：與治療前比較①P＜0.05；與對照組對應時間點比較②P＜0.05。

圖1 血細胞中GATA－3蛋白表達水平結果Figure 1 The western blot results of the protein expression of GATA－3in blood cells

3 討論

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。發病率有逐年上升趨勢，據統計全球哮喘兒童發病率為3.3%～29%，成人為1.2%～25.5%［1－6，16］。未得到有效控制的哮喘患者，氣道炎癥反應逐步加重，可進展為不完全可逆性通氣功能障礙，全球每年因哮喘致死的患者接近2萬人［1－6，16］。近年來隨著 全球哮喘 防治創議（The Global Initiative for Asthma，GINA）的普及以及吸入激素加長效β2激動劑聯合藥物（ICS＋LABA）的推廣，哮喘患者的臨床控制水平有了較大幅度的提高，但由于哮喘復雜的發病機制、患者機體不同的免疫狀態以及個體差異等因素的存在使治療效果具有明顯的異質性，再加上藥物相關的不良反應限制了藥物的應用，這些因素共同影響了哮喘患者的療效和預后，統計顯示哮喘的急性發作率和住院率并未見顯著下降［1－6，16］。因此，有必要從哮喘發病的根本機制入手尋求新的治療藥物，阻止疾病進展，使哮喘患者獲得更佳的臨床控制。

他汀類藥物對哮喘動物模型有保護作用［16－19］。瑞舒伐他汀可以通過下調Th2 細胞因子（IL－4、IL－5和IL－13）分泌顯著抑制小鼠氣道炎癥反應和粘液的過度分泌［16］。可減輕哮喘小鼠炎癥細胞浸潤，并能明顯降低BALF 中嗜酸性粒細胞比例和TNF－α 的濃度［19］。我們在給予中到重度的成年哮喘患者ICS／LABA 的基礎治療上對干預組患者給予瑞舒伐他汀20mg／天的輔助治療，該結果表明瑞舒伐他汀輔助治療能夠有效改善中到重度的成年哮喘患者的肺功能狀態。

哮喘被認為是與T 細胞介導的變態反應密切相關的氣道炎癥性疾病。肺組織內抗原提呈細胞（APC）吞噬處理抗原后將抗原信息呈遞給靜息型T細胞（naive T cells），誘導其分化為Th1和Th2效應性T 細胞參與細胞和體液免疫應答。在哮喘患者氣道中原有的Th1／Th2 免疫應答平衡出現了Th2 偏移，過度活化增殖的Th2細胞可分泌IL－4、IL－5和IL－13等多種炎癥介質。同時Th2細胞相關的細胞因子和炎癥介質具有趨化募集嗜酸性粒細胞（EOS）至抗原入侵部位誘發氣道高反應性；直接和間接刺激氣道柱狀上皮的杯狀上皮化生導致粘液過度分泌；誘導肥大細胞脫顆粒；誘導B細胞過度活化增殖及IgE 釋放的作用。以上因素最終導致哮喘患者氣道炎癥的持續與急性發作，也是導致氣道重構的重要原因［20，21］。目前認為Th2免疫應答增強和嗜酸性粒細胞浸潤在哮喘的發生發展過程中扮演著重要的角色［16－24］。研究發現他汀類藥物可通過下調MHC II相關分子表達，抑制效應性T 細胞的活化［13，14］。Mira等發現洛伐他汀可通過CCL1通路增加負性調節細胞Treg的數量，促使Th1／Th2平衡的重建［13］。我們的臨床研究發現在給予有效治療后哮喘患者血中IL－4、IL－5和IL－13水平均較治療前顯著降低（P 均＜0.05），且干預組患者指標降低更加顯著（P 均＜0.05）。該結果表明對于中到重度的成年哮喘患者瑞舒伐他汀輔助治療能夠有效抑制哮喘相關的炎癥反應。

GATA－3是調節Th0向Th2細胞分化的關鍵核轉錄因子和調節因素，GATA－3 表達的增加與Th1／Th2免疫應答時Th2失衡程度呈正相關性［7－9，12］。在本臨床實驗中我們使用qPCR 和western blot法對哮喘患者血細胞中GATA－3的mRNA 和蛋白表達水平進行了檢測。我們發現在有效的干預后中到重度的成年哮喘患者血細胞中GATA－3的表達均有顯著的降低，且干預組患者降低的程度更加明顯。該結果表明瑞舒伐他汀對哮喘患者Th1／Th2免疫應答失衡有顯著的改善作用。同時在該臨床研究過程中我們未見與治療藥物相關的嚴重不良反應發生。

4 結論

瑞舒伐他汀可以通過糾正Th1／Th2免疫失衡改善支氣管哮喘的炎癥水平和肺功能。該臨床實驗為瑞舒伐他汀應用于支氣管哮喘的臨床治療奠定了基礎。但仍需進一步的多中心大樣本量臨床研究明確其價值和意義。

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