植物SSR分子標記技術的應用

劉　何，辛　艷

（天津市種子管理站，天津 300060）

植物SSR分子標記技術的應用

劉何，辛艷

（天津市種子管理站，天津 300060）

目前，植物基因組學研究中SSR標記的應用較為活躍。該種標記具有近于均勻覆蓋基因組、多態性高等優點，在植物高密度遺傳圖譜繪制、DNA指紋圖譜構建、種系純度與親緣關系鑒定以及植物遺傳進化方面具有公認的優越性。不足之處在于位點特異性SSR標記的建立先要根據微衛星側翼序列進行引物設計，所以引物的高開發成本一直是非商業化物種SSR標記遺傳研究的主要障礙，而且很多根據檢索得到的引物的多態性效果不佳，因此尋找一種快速廉價的引物篩選方法已成為SSR應用的熱點問題。這幾年開發出了多種基于SSR標記的方法，如ISSR、SAMPL等。

簡單序列重復；微衛星；DNA標記；植物育種

植物相關的簡單序列重復（Simple Sequence Repeats， SSR）標記技術已用于小麥、水稻、大豆等主要大田作物和油菜、甘藍、黃瓜等多種園藝植物的基因組學研究［1-2］，該技術在植物高密度遺傳圖譜繪制、目的基因定位、指紋圖譜構建、種系純度檢驗及植物遺傳進化研究等方面有公認的優越性［3-5］。

1　DNA分子標記

分子水平的遺傳標記是以DNA、蛋白質等生物大分子多態性（指序列、結構等特征存在多種形式）為基礎的標記。而DNA標記是因DNA發生缺失、插入、易位、倒位或由于存在長短與排列不一的重復序列等機制而產生的多態性標記。具有可遺傳、可識別性，可以是某個結構基因的一部分或是DNA非編碼區序列［1］，亦或是經限制性酶切處理產生的多態性DNA酶切片斷形式。

DNA分子標記較其他標記形式的優點是：（1）基于DNA水平檢測，能揭示物種本質而不受個體發育水平和環境條件干擾；（2）數量眾多，遍布于整個基因組，編碼區與非編碼區序列都可作為標記，另外，DNA標記利用基因組變異檢測的結果具有較高多態性，克服了單純利用基因標記的缺點，擴增片段長度多態性（AFLP）、單核苷酸多態性（SNP）都基于DNA的點突變檢測［6-7］，SSR標記能檢測到較高的單基因座位多態性［8］；（3）許多標記表現共顯性遺傳，可區分個體的純合性與雜和性［1］。

2　SSR標記技術

2.1SSR的構成

SSR的發現最初始于動物基因組［4］。之后，人們發現幾乎所有真核基因組中都存在重復序列（現在細菌DNA中也有發現［9］，也稱衛星DNA［10］，DNA復性動力學進一步證明這類序列往往由大的重復單位嵌套若干小的乃至更小的串聯重復單位構成。依據這些單位的重復程度，進一步分為輕度重復序列、中度重復序列和高度重復序列［11］。

高度重復序列是簡單重復單元的高度重復形式，重復序列的單位長度可以為1～6個核苷酸［1，9］，重復次數可從幾百次到幾百萬次拷貝數，所以也稱為微衛星DNA（microsatellite DNA）［11］或短的串聯重復序列（Short Tandemly Repeats，STRs）［12］。已知微衛星序列的重復形式多樣，在基因組中近于均勻分布，其分布情況與基因組大小有關［9］，果蠅染色體著絲點附近的微衛星有ACAAACT、ATAAACT、ACAAAATT等形式，拷貝數分別達1.1×107，3.6×107，3.6×107［11］。Skinner等在寄居蟹基因組中發現一種微衛星形式為（TAGG）n［12］。植物中通過對擬南芥、小麥、水稻等研究，證明SSR在基因組中含量很豐富，已發現的微衛星有（CA）n，（AT）n，（GC）n，（GATA）n，等等，其重復次數多在10～60之間［6］。最常見的為雙核苷酸重復（GA）n，（AC）n是小麥和水稻中最普遍的雙核苷酸重復形式。小麥中（AC）n拷貝數達3 000，（GA）n重復次數在6 000以上；水稻中（AC）n與（GA）n重復次數分別達1 000 和2 000以上。栽培型花生中常見的是（GA）n微衛星［13］。植物中存在的三核苷酸重復、四核苷酸重復單位常見的有（AAG）n、（AAT）n，雙子葉與單子葉植物的微衛星數量、分布都是不同的。植物葉綠體中也發現微衛星的存在［6］。Toth等已對大量微衛星類型及分布情況作了較細致的總結［9］。

由于SSR重復單位的差異，人們把微衛星分為核心區（Core Sequences）與兩側的側翼序列。核心區由短的重復單位組成，每個單位的堿基數目一般不變。重復次數是高度變異的，不同個體可能差別很大，所以又稱為串聯重復數目變異（VNTR）多態性。通過評估VNTR的差異可實現對個體的識別［14］。根據重復單位的排列方式，Weber等將核心區分為完全型（Perfect）、不完全型（Imperfect）和復合型（Compound）。完全型微衛星是由不中斷的重復單位構成的；不完全型其重復序列中間有3個以下的非重復堿基，兩側不中斷的部分重復數大于3；復合型指兩類或兩類以上的串聯重復單位由3個連續的非重復堿基分隔開，但不中斷的重復單位的重復數不小于5［4］。核心區兩側為側翼區，其突變少，一般是單拷貝的結構基因區。Toth等［9］報道真核基因組中位于內元（ntron）、基因間隔區（Intergenic Region）等非編碼區中的SSR要多于功能基因區中的SSR，所以SSR與功能基因可能存在遺傳連鎖關系［5，15］。

關于SSR高變異性，目前主要有兩種假說：DNA聚合酶滑動錯配假說和不均等重組假說［9，11］。

SSR對于調節轉錄活性、保護DNA完整性、特殊轉錄因子編碼、基因重組與基因組進化有特殊意義［4，9］。

2.2SSR標記

微衛星的VNTR特性與高度變異易于形成多位點多態性或親子代特異性位點的多態性，通過這些不同的變異就可發現不同的SSR在不同種間甚至于不同個體間的差異。Jeffreys最初就提出利用真核DNA中的小衛星串聯重復序列來預測個體的特異性［14］。另外，根據SSR與結構基因的關系，使得SSR對于QTL定位、高密度遺傳圖譜構建都有重要幫助。范云六等［16］用微衛星標記結合分離群體分組分析把R55小麥中的抗條銹病基因定位在染色體1BS上，證實該抗病基因來自圓錐小麥。劉亞萍等［17］用兩對引物定位了小麥抗條銹病基因Yr24，確定了其與SSR位點間的遺傳距離。

SSR標記的基本原理為將生物個體微衛星側翼序列DNA片斷克隆、測序，根據側翼序列人工合成引物進行PCR擴增，將單個座位的微衛星擴增出來，產物具有簡單序列重復長度多態性（SSLP），每一擴增位點代表該位點上的一對等位基因，通過高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳來區分該多態性。非特異性SSR標記是利用核心序列制成的1個，2個或3個堿基組成的各10，15，30等次數的寡聚DNA探針與基因組文庫雜交，進行檢測，經Southern雜交，放射自顯影等步驟得到DNA指紋，實現對品系純度鑒定、雜交優勢預測等研究［15］，由于其簡便易行，分析迅速，在實際中有廣泛應用［17］。但該法不能確定單個位點的在基因組上的位置，不能用于基因定位研究且產生的譜帶過多，也不利于用計算機數據庫進行統計分析［14］。隨著毛細管電泳（Capillary Electrophoresis， CE）、多重PCR熒光標記基因組掃描等新技術應用，SSR標記分析將更加快速便捷，同時檢測通量將大大提高。

SSR標記的優點在于：數量豐富，近于均勻覆蓋整個基因組，揭示的多態性高，尤其適于水稻［1］、花生、小麥［3］、黃瓜［2］等特殊基因組的檢測；共顯性遺傳；樣品DNA取樣少；另外每個位點由設計的引物順序決定，便于不同的實驗室相互交流合作開發引物。正因如此，我國農業部主管機構已經組織全國重點科研機構制定了針對玉米、水稻、棉花等多種農作物品種的SSR檢測技術的行業標準或國家標準并預計于2015推出新版標準及CE檢測平臺的全國統一的數據檢索信息庫以整合各地得出的試驗數據。

2.2.1SSR標記的開發

SSR標記基于PCR反應，引物的準確程度對于檢測結果非常重要［18］。位點特異性SSR標記的建立先要構建基因組文庫，并根據微衛星側翼序列進行引物設計［4，19］，所以高開發成本一直是非商業化物種常規SSR標記研究應用的主要障礙［5］。尋找快速廉價的引物篩選方法是SSR應用的重點問題［12］。

常規標記篩選法是酶切基因組DNA，構建小片斷基因組文庫，用合成的探針與文庫雜交鑒定微衛星序列［3］，然后進行陽性克隆的測序與引物設計，所設計的引物必須經過PCR并在對應克隆和基因組DNA中擴增出預計產物，工作量相當大。McFadden等［4］利用常規法篩選出甘藍型油菜基因組文庫，對獲得的140個陽性克隆進行測序，設計了21對引物，有17對得到理想產物，13對引物擴增產物表現為多態性。Marion S.等從六倍體面包小麥基因組中開發出230對引物，擴增出279個微衛星位點，有20%的標記檢測到1個以上的位點［3］。

引物的獲得也可由相關文獻［16］或DNA數據庫如EMBL、GenBank上進行檢測［17］，大多數農作物都可找到對應SSR引物。但實際檢測效果證明此類引物的檢測效果往往不如用基因組篩選獲得引物的多態性好，例如從EST獲得SSR的多態性為54%；而基因組篩選得到的SSR引物多態性達到83.8%［4］。沈金雄等［20］報道根據檢索的196對引物，有75對可篩選出產物，其中僅40對能檢測出1個位點，最多可檢測出5個位點；一般需要2～3對引物才能把親本材料區分開。

總的看來，SSR標記檢測的不足在于引物的開發，另外與AFLP相比，SSR座位突變率高，容易受到趨同變異引起的平行演化的影響，可能給親緣關系評估帶來誤差，SSR分析的結果也與植物遺傳背景密切相關。

2.2.2SSR標記技術的發展

近幾年已開發出多種基于SSR標記的方法。簡單重復間序列（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR），也稱錨定SSR（anchored simple sequence repeats）［21］，是直接利用被標記的SSR引物，擴增SSR間的單拷貝序列。引物設計時在5'端和3'端分別加上1-2個選擇性堿基，使得退火溫度提高，引物有更強的專一性，降低了雜帶的干擾，增加了擴增特異性和試驗結果可重復性［1］。ISSR引物的開發不需對側翼序列單獨測序，開發費用降低［2］，它結合了RAPD與SSR的優點，耗資更少。其引物可以在不同的物種間通用而不像SSR標記一樣有較強的物種特異性；與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美［1，19］。ISSR廣泛應用于多種植物的指紋圖譜繪制。Prevol等［1］用4 個ISSR標記對34個馬鈴薯品種檢測，有兩個引物完全可以將這些品種區分開。Ammiraju等［19］通過ISSR技術已找到與小麥籽粒大小相關的QTL。

選擇性擴增微衛星多態性位點（Selective Amplification of Microsatellite Polymorphism Loci，SAMPL）是SSR與AFLP相結合的分子標記。它利用微衛星序列設計引物，不需預先對微衛星位點進行克隆和測序。方法是在AFLP反應的第二次擴增時將一個具有3個選擇性堿基的AFLP引物與一個16-18 bp的人工SAMPL引物組合在一起，由于SAMPL引物的特異性［12，19］，在擴增時，SAMPL引物5'端重復提供進行嚴格復性的5'端錨定位點，因而該引物的3'端的第二個微衛星就可延伸。根據不同的限制性內切酶、SSR引物及選擇性接頭引物的組合，SAMPL所揭示的多態性幾乎是無限的。與其他方法相比，其結果可能最有價值［5，15］。另外還有RAPD與SSR結合的隨機擴增微衛星多態性法等等。

3　SSR標記應用

微衛星標記廣泛用于重要性狀基因定位及分子標記輔助育種研究。已利用微衛星標記建立了與水稻抗白枯病基因、蠟質基因，大豆抗條紋花葉病和大豆開花期基因連鎖的微衛星標記［1］。親緣關系鑒定方面，Manifesto等對105份小麥品種用位于不同染色體上的探針檢測后發現親緣關系越近的品種，指紋譜的相關系數越高。郭旺珍等用SSR標記對棉屬二倍體及四倍體種進行遺傳多樣性分析，揭示出屬于D染色體組的擬似棉與其他D染色體組棉種的相似系數最低，A、D染色體組間相似系數很高［22］。韓麗娟等［23］在大豆疫霉菌研究中指出應用SSR標記確定生理小種間親緣關系是可行的。Pestson等利用18對微衛星標記對113份二倍體粗山羊草進行分析，認為微衛星標記非常適于遺傳多樣性分析。Diwan等［1］用20個SSR位點成功地將17個用AFLP未能完全區分開來的栽培大豆分開。Weising等認為對于品種鑒別來說，SSR標記比RAPD等標記更加優越，獲得的資料便于在不同實驗室間共享。

由于PCR-SSR標記法比RFLP更易操作和宜于實現自動化，所以利用很少的微衛星即可進行遺傳多樣性分析及系統進化研究。Peil等用該標記鑒定了普通小麥種間的代換系。而Procunier等鑒定了四倍體小麥的異附加系。值得注意的是有些微衛星雖然是位點特異性的，但并不具備相應的部分同源性，與RFLP相比，所揭示的部分同源性是很低，因而在染色體的部分同源性鑒定及比較作圖中的應用受到了一定限制。

［1］周延清. 遺傳標記的發展［J］.生物學通報，2000，35（5）：17-18.

［2］葛鳳偉，張海英，陳青君，等.黃瓜SSR反應體系的建立［J］.華北農學報，2004 ，19（2）：5-9.

［3］唐榮華， 張君誠，吳為人，等. SSR分子標記的開發技術研究進展［J］.西南農業學報，2002，15（4）：106-109.

［4］劉列釗，林吶. 油菜簡單重復序列SSR研究進展［J］.生命科學，2004，16（3）：173-176.

［5］ Hayden M J， et al. Targeted development of informative microsatellite markers［J］.Nucleic Acids Research，2001，29 （8）：1697-1704.

［6］張獻龍. 植物生物技術［M］.2版.北京：科學出版社，2012.

［7］賀竹梅.現代遺傳學教程［M］.廣州：中山大學出版社，2002.

［8］Antonio A F G. Comparison of RAPD，AFLP，RFLP，SSR markers for diversity studies in tropical maize inbred line［J］.Genet and Mol Bio，2004，27（4）：3.

［9］Gábor Tóth. Microsatellite in different eukaryotic genome: Survey and analysis［M］.New York: Cold Spring Harbor Lab Press，2005.

［10］吳乃虎.基因工程原理［M］.2版.北京：科學出版社，2001.

［11］孫乃恩，孫東旭，朱德煦，等. 分子遺傳學［M］.南京：南京大學出版社，1990.

［12］張志敏，熊國梅，王慧娟，等. 簡單重復序列的篩選與應用［J］.生命的化學，2004，24（3）：254-257.

［13］He G H.Microsatellite as DNA markers in cultivated peanut［J］.BMC Plant Biology，2003（3）：3.

［14］沃克J M，拉普勒R. 分子生物學與生物技術［M］.北京：化學工業出版社，2003.

［15］管峰，楊利國，賈名威，等. 微衛星的構成及其檢測技術［J］.生物學雜志，2004，21（2）：1-3，13.

［16］范云六. 我國農作物生物技術的成就與展望［J］.世界科技研究與發展，1999（1）：11-15.

［17］劉亞萍，曹雙河，王獻平，等. 小麥抗條銹病基因Yr24的SSR標記［J］.植物病理學報，2005，35（5）：478-480.

［18］李汝玉，李群，譚振馨，等. 利用SSR標記技術檢測玉米雜交種純度［J］.玉米科學，2005，13（1）：15-18.

［19］王建波. ISSR分子標記及其在植物遺傳學研究中的應用［J］.遺傳，2002，24（5）：613-616.

［20］沈金雄，傅廷棟，楊光圣，等. 甘藍型油菜SSR、ISSR標記的遺傳多樣性及其與雜種表現的關系［J］.中國農業科學，2004，37（4）：477-483.

［21］黎裕，賈繼增，王天宇，等. 分子標記的種類及其發展［J］.生物技術通報，1999（4）：21-24.

［22］郭旺珍，王凱，張天真，等.利用SSR標記技術研究棉屬A、D染色體組的進化［J］.遺傳學報，2003 ，30（2）：183-188.

［23］韓麗娟，劉文洪. 大豆疫霉病及其遺傳多樣性的研究方法［J］.分子植物育種，2004，2（6）：877-883.

Q78

A

1002-0659（2015）05-0034-04

2015-07-08

天津市農業局青年人才培育項目（201306）

主要作者簡介：劉何（1978-），男，農藝師，主要從事種子質量檢驗工作。E-mail：23120207@qq.com