重組病毒Ac MNPV-BmK IT侵染Sf9細胞后凋亡相關基因的表達分析

付月君， 林桃桃， 梁愛華

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006）

重組病毒Ac MNPV-BmK IT侵染Sf9細胞后凋亡相關基因的表達分析

付月君*， 林桃桃， 梁愛華

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006）

將從東亞鉗蝎中克隆到的興奮型昆蟲毒素基因（BmK IT）同源重組到苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Ac MNPV）基因組中，得到重組病毒Ac MNPV-BmK IT，抗蟲試驗表明重組桿狀病毒的殺蟲活性明顯優于野生型病毒，但Ac MNPV介導的BmK IT的抗蟲分子機制尚未闡明。本試驗從草地貪夜蛾Sf9細胞中克隆獲得了凋亡相關基因Sfp53，制備了抗體，分析了Ac MNPV-BmK IT對Sfp53表達的影響，結果表明被重組病毒感染的細胞所表達的Sfp53時間與表達量與野生型相比都有所提前和提高，說明重組病毒可加速細胞的凋亡；同時通過半定量PCR分析了Ac MNPV-BmK IT感染Sf9細胞時病毒抗凋亡基因iap2的表達，結果表明重組型病毒抗凋亡基因iap2表達量減少。以上結果在細胞分子水平上解釋了Ac MNPV-BmK IT殺蟲活性提高的原因。

Ac MNPV-BmK IT； 凋亡；Sfp53；iap2

蝎使用其毒液作為狩獵和自衛的武器，毒液的有效成分是一組由30～80個氨基酸組成的具有神經毒性的多肽［1-2］。蝎神經毒素按其作用對象大致可分為3類：哺乳動物神經毒素（MTx）、昆蟲神經毒素和甲殼動物神經毒素（CTx）［3］。興奮型昆蟲神經毒素的注入可以引起蟲體快速興奮性收縮麻痹［4］。本課題組將從東亞鉗蝎中克隆到的興奮型蝎昆蟲毒素基因（BmK IT）與苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californicamulticapsid nucleopolyhedrovirus，Ac MNPV）基因組同源重組，得到重組桿狀病毒Ac MNPV-BmK IT，BmK IT基因受極早期啟動子IE1 promoter調控。接著，本課題組分別用重組桿狀病毒和野生型桿狀病毒感染棉鈴蟲幼蟲，結果表明，重組桿狀病毒的殺蟲活性明顯優于野生型桿狀病毒，與Fan等［5］報道的結果一致。本研究通過檢測細胞凋亡相關基因和病毒抑制凋亡相關基因的表達來分析Ac MNPV介導的BmK IT的抗蟲分子機制。

細胞凋亡過程是對細胞死亡的調控，它不僅可以消除多余的正常細胞，也是一種抵抗外源基因的表達與病毒入侵的防御機制［6］。p53蛋白家族參與細胞周期調控、腫瘤的抑制、細胞的凋亡，其可分為無脊椎來源和有脊椎來源［7-9］。Ac MNPV的宿主草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）細胞中分離出來的Sfp53是一種與鱗翅目昆蟲同源的凋亡蛋白。Sfp53的過量表達會誘導細胞的凋亡，但其不會像黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）p53基因（Dmp53）那樣，受到UV或CPT（camptothecin）處理后，其內源性的Sfp53也會增加［10］。在病毒基因組中，有兩種抗凋亡基因：p35與凋亡抑制基因iap（inhibitor of apoptosis）［11］。抗凋亡基因iap首先從蘋果蠹蛾顆粒體病毒CpGV（Cydia pomonella granulosis virus）和黃杉毒蛾核型多角體病毒Op MNPV（Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus）中被分離鑒定出來，它所編碼的蛋白可以抑制由p35缺失型重組病毒Ac MNPV所誘導的Sf21的凋亡［12-13］。

本試驗從草地貪夜蛾Sf9細胞中克隆獲得了凋亡蛋白Sfp53基因，構建了pRSETc-Sfp53表達載體，利用Western blot分析了Ac MNPV-BmK IT對細胞凋亡蛋白Sfp53的影響，同時通過半定量PCR分析了Ac MNPV-BmK IT感染Sf9細胞時病毒抗凋亡基因iap2的表達情況，從而為重組病毒Ac MNPV-BmK IT生物殺蟲劑的研發及明確其作用機制提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌種、質粒、病毒

草地貪夜蛾細胞（Sf9）、大腸桿菌（Escherichia coli）XL10及野生型苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Ac MNPV由本實驗室保存；質粒p RSETc-BmK CT和Ac MNPV-BmK IT由本實驗室構建；p MD-18T購自TaKaRa公司。

1.2 主要工具酶及生化試劑

昆蟲細胞培養基TNM-FH（Sigma公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RNAisoTMPlus（TaKaRa公司）；反轉錄試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit）、DNA限制性內切酶（Thermo公司）；PCR擴增所用EasyTaq酶、T4DNA連接酶和核酸分子量標準（TransGen公司）；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG（Invitrogen公司）。

1.3 昆蟲Sf9細胞培養

將50.6 g TNM-FH粉末懸于1 L去離子水中，同時加0.35 g碳酸氫鈉，攪拌溶解，調節p H至6.2～6.4，使用滅菌的0.22μm濾膜濾器過濾除菌，配以50μg/mL慶大霉素備用。取出液氮中凍存的Sf9細胞，迅速置于27℃水浴中，待完全融化后1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。細胞沉淀用含胎牛血清及抗生素的培養基懸浮，轉移至培養面積為25 cm2的細胞培養瓶中，培養基加至5 mL，于27℃細胞培養箱培養。

1.4 試驗方法

1.4.1 Sf9細胞總RNA的提取

將Sf9細胞接種于6孔板中，待長滿一層細胞時加入1 mL 1×PBS清洗細胞、再加入1 mL RNAisoTMPlus裂解細胞，用移液槍反復吹打細胞使其脫落，將細胞裂解液轉移至離心管中反復吹吸，直至裂解液中無明顯沉淀后室溫靜置5 min。向離心管中加入200μL氯仿，用力振蕩，待乳化溶液呈乳白狀（無分相現象）后室溫靜置5 min，12 000 g，4℃離心15 min。離心后勻漿液分為3層：無色的上清液、中間的白色蛋白層及下層有機相，吸取上清液轉移至另一新的離心管中，向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管，充分混勻后，在室溫下靜置10 min，12 000 g，4℃離心10 min，試管底部會出現白色沉淀，棄去上清液，沿離心管壁加入現配的75%冷乙醇l mL，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12 000 g，4℃離心5 min后小心棄去乙醇。室溫干燥沉淀至沒有乙醇殘留，加入適量的RNase-free水溶解沉淀，即得Sf9細胞總RNA。

1.4.2 cDNA第一鏈的合成

采用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，以Oligo d T為引物，將總RNA中的mRNA反轉錄為cDNA，反應條件為：45℃1 h；70℃10 min；終止反應。

1.4.3Sfp53基因的克隆

根據GenBank數據庫中檢索到的Spodoptera frugiperda p53 cDNA序列（GenBank accession No.HM773026.1），設計用于擴增Sfp53全長的引物（表1），酶切位點分別為XhoI和NheI（表1中下劃線標出）。將cDNA模板稀釋10倍，進行PCR擴增。反應條件為：94℃5 min；94℃30 s；53℃30 s；72℃90 s循環30次；72℃10 min。將PCR擴增獲得的Sfp53基因構建于克隆載體p MD18-T中，得到p MD18-T-Sfp53，經測序確定其序列正確。

表1 PCR擴增Sfp53和iap2基因所用引物及相關參數Table 1 The primer sequences and relative parameters for PCR amplification ofSfp53 andiap2 genes

1.4.4 重組表達質粒pRSETc-Sfp53的構建

將p MD18-T-Sfp53用NheI和XhoI雙酶切后進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化得到目的基因Sfp53片段。分別用NheI和XhoI酶切表達載體pRSETc-BmK CT，切膠回收載體pRSETc。連接酶切后的表達載體pRSETc與Sfp53片段（圖1）。將測序正確的重組表達質粒pRSETc-Sfp53送生工生物工程（上海）股份有限公司制備Sfp53抗體。

圖1 表達質粒pRSETc-Sfp53的構建流程Fig.1 Construction of the expression vector pRSETc-Sfp53

1.4.5 Western blot分析Ac MNPV-BmK IT感染Sf9細胞后Sfp53蛋白的表達

用含血清的昆蟲細胞培養基（TNM-FH）將Sf9細胞稀釋為5×105個/mL，加2 mL到6孔板中。細胞培養板于27℃培養過夜，次日棄去舊培養基，依次加入無血清培養基（TNM-FH）、2.28×1012vp/ mL的Ac MNPV和Ac MNPV-BmK IT病毒分別感染細胞6、12、21、27、33、39、45 h，共設7個處理，每處理3次重復。提取細胞總蛋白，取5μL用BCA試劑測蛋白濃度，另取總蛋白與Loading buffer按5∶1混勻，金屬浴95℃5 min，進行SDS-PAGE電泳。電泳完畢將膠于轉膜槽中轉印1.5 h。轉印完畢，將PVDF膜用PBST清洗后，在封閉液中封閉1 h，期間緩慢搖動。封閉后，將目的蛋白與標準分子量大小進行比較，確定所需目的蛋白位置，剪下所需的膜，將膜用塑料膜封好，留下一小口以便加Sfp53抗體。將抗體稀釋2 000倍，從小口中加入，封好，置于4℃孵育過夜。用PBST洗去未結合的一抗，每次10 min，洗滌3次。將PVDF膜在辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗中孵育1 h（二抗稀釋比例為1∶6 000），再用PBST洗去未結合的二抗，每次10 min，洗滌3次。在暗室內通過ECL試劑盒曝光顯影。

1.4.6 半定量PCR分析Ac MNPV-BmK IT感染Sf9細胞后抗凋亡基因iap2的轉錄水平

用有血清的昆蟲細胞培養基（TNM-FH）將細胞稀釋為5×105個/mL，加2 mL到6孔板中，27℃培養箱過夜培養。次日棄去舊培養基，依次加入無血清培養基（TNM-FH），濃度為2.28×1012vp/mL Ac MNPV和Ac MNPV-BmK IT病毒，感染細胞時間為36和60 h，每組3次重復。提取細胞內總RNA，反轉錄成cDNA。設計用于擴增iap2全長的引物，見表1。將cDNA模板稀釋10倍，測定cDNA濃度，保證模板初始量相同條件下進行PCR擴增，反應條件為：94℃5 min；94℃30 s；51℃30 s；72℃1 min循環25次；72℃10 min。等體積PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，EB染色。通過BandScan軟件對條帶灰度進行積分，并進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 Sf9細胞總RNA的提取及Sfp53基因的克隆

利用RNAisoTMPlus總RNA提取試劑盒提取Sf9細胞的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，可檢測到清晰的28S、18S和5S三條帶（圖2a），表明所提Sf9的總RNA完整。利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit，以Oligo dT為引物合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，擴增得1 125 bpSfp53序列（圖2b），經測序證實擴增目的條帶序列正確。

圖2 重組表達質粒pRSETc-Sfp53的鑒定Fig.2 Analysis of recombinant plasmid pRSETc-Sfp53

2.2 重組表達質粒pRSETc-Sfp53的鑒定及Sfp53的抗體制備

根據方法1.4.4構建好重組質粒pRSETc-Sfp53，并進行雙酶切和PCR鑒定（圖2c，d），結果顯示質粒構建成功，質粒經測序證實構建正確。將重組質粒交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行制備抗體，獲得了Sfp53的多克隆抗體。

2.3 Western blot分析Ac MNPV-BmK IT對凋亡

蛋白Sfp53表達量的影響

如圖3a所示，重組Ac MNPV-BmK IT感染Sf9細胞12～33 h時，凋亡蛋白Sfp53的表達量增加，39 h以后Sfp53的表達量減少，說明在感染細胞12～33 h時細胞發生凋亡，39 h后細胞凋亡速度減慢，而野生型Ac MNPV感染細胞21 h后，凋亡蛋白Sfp53的表達量才有所增加且增加量不及重組型，感染45 h后Sfp53的表達量小幅度減少，說明野生型Ac MNPV感染Sf9細胞21 h后凋亡主要蛋白Sfp53才開始大量表達，且一直持續到45 h后，凋亡持續時間較長。重組型與野生型病毒處理組相比，前者誘導Sf9細胞的凋亡時間早，持續時間短，加速了細胞凋亡的進程。

圖3 Western blot分析AcMNPV-BmK IT對Sf9細胞凋亡相關蛋白Sfp53表達的影響Fig.3 Effects of Ac MNPV-BmK IT on the expression of apoptosis-related protein Sfp53 by Western blot assay

2.4 半定量PCR分析Ac MNPV-BmK IT感染Sf9細胞后抗凋亡基因iap2的轉錄水平分析

如圖4a所示，與野生型AcMNPV處理組相比，重組AcMNPV-BmK IT感染Sf9細胞后，病毒的抗凋亡基因iap2表達急劇減少，病毒的抗凋亡能力減弱，表明Sf9細胞凋亡被抑制程度減弱。經t檢驗，同一時間作用下各處理組之間P值小于0.01，差異極顯著，說明重組病毒抑制病毒的抗凋亡能力強，加速了宿主細胞的凋亡。

圖4 半定量PCR分析AcMNPV-BmK IT感染Sf9細胞對抗凋亡基因iap2轉錄水平的影響Fig.4 Effects of AcMNPV-BmK IT on the transcription level of the inhibitor of apoptosis geneiap2 by semi-quantitative PCR assay

3 結論與討論

病毒AcMNPV的復制可以引起Sf9細胞DNA的損傷，同時增加Sfp53的積累；抑制DNA的損傷可以阻止Sfp53的積累，但通過RNA干擾試驗沉默Sfp53基因的表達并不影響AcMNPV的復制［14］。本試驗表明，AcMNPV-BmK IT可以提高細胞中Sfp53的積累，推測是由于BmK IT通過調控Sf9細胞膜的鈉通道，進而影響細胞內環境，從而增強了病毒的復制能力，提高了Sfp53的表達量，表明BmK IT不是從基因水平上影響細胞凋亡的調控，而是在細胞內環境上調控Sfp53蛋白的表達或積累，從而引起細胞凋亡，加強殺蟲能力的。

有結果顯示Ac MNPV感染Sf9細胞時可以引起凋亡抑制蛋白IAP表達量的降低，IAP下調也可以由病毒DNA的復制所觸發，其原因部分是由于某些蛋白酶的介導［15］。與野生型病毒處理組相比，Ac MNPV-BmK IT感染細胞時，iap2的表達得到抑制，推斷BmK IT通過調控細胞內環境從而影響了病毒DNA的復制或凋亡，抑制蛋白IAP表達下調酶表達。本試驗是從轉錄水平檢測iap2的表達，以后的工作還可開展IAP蛋白表達和IAP表達下調相關酶的檢測。有報道發現桿狀病毒的IAPs可以阻斷Sf-caspase-1的激活［16］，本試驗結果顯示重組病毒的iap2基因的表達大幅下調，這是由BmK IT引起的，下一步工作可分析這種下調對加速細胞凋亡的影響。

本文分析了重組病毒Ac MNPV-BmK IT侵染Sf9細胞后細胞內Sfp53和病毒iap2的表達情況，為重組病毒Ac MNPV-BmK IT生物殺蟲劑的研發及作用機制研究提供了試驗依據。

［1］ Moskowitz H，Hermann R，Jones A D，et al.A depressant insect-selective toxin analog from the venom of the scorpionLeiurus quinquestriatus hebraeu-purification and structure/ function characterization［J］.European Journal of Biochemistry，1998，254（1）：44 49.

［2］ Cestele S，Catterall W A.Molecular mechanisms of neurotoxin action on voltage-gated sodium channels［J］.Biochimie，2000，82（9/10）：883 892.

［3］ Zilberberg N，Gordon D，Elhatem P，et al.Functional expression and genetic alteration of an alpha scorpion neurotoxin［J］. Biochemistry，1996，35（31）：10215 10222.

［4］ Gurevitz M，Froy O，Zilberberg N，et al.Sodium channel modifiers from scorpion venom：structure-activity relationship，mode of action and application［J］.Toxicon，1998，36（11）：1671 1682.

［5］ Fan X J，Zheng B，Fu Y J，et al.Baculovirus-mediated expression of a Chinese scorpion neurotoxin improves insecticidal efficacy［J］.Chinese Science Bulletin，2008，53（12）：1855 1860.

［6］ Ikeda M，Yanagimoto K，Kobayashi M，et al.Identification and functional analysis ofHyphantria cunea nucleopolyhedrovirus iapgenes［J］.Virology，2004，321（2）：359 371.

［7］ Lane D P，Cheok C F，Brown C J，et al.TheMdm2 andp53 genes are conserved in the Arachnids［J］.Cell Cycle，2010，9（4）：748 754.

［8］ Lu W J，Amatruda J F，Abrams J M.p53 ancestry：gazing through an evolutionary lens［J］.Nature Reviews Cancer，2009，9（10）：758 762.

［9］ Mendoza L，Orozco E，Rodriguez M A，et al.Ehp53，anEntamoeba histolyticaprotein，ancestor of the mammalian tumour suppressor p53［J］.Microbiology，2003，149（4）：885 893.

［10］Huang N，Clem R J，Rohrmann G F.Characterization of cDNAs encoding p53 ofBombyx moriandSpodoptera frugiperda［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2011，41（8）：613 619.

［11］Clem R J.Baculoviruses and apoptosis：the good，the bad，and the ugly［J］.Cell Death and Differentiation，2001，8（2）：137 143.

［12］Birnbaum M J，Clem R J，Miller L K.An apoptosis-inhibiting gene from a nuclear polyhedrosis virus encoding a polypeptide with Cys/His sequence motifs［J］.Journal of Virology，1994，68（4）：2521 2528.

［13］Crook N E，Clem R J，Miller L K.An apoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif［J］.Journal of Virology，1993，67（4）：2168 2174.

［14］Huang N，Wu W，Yang K，et al.Baculovirus infection induces a DNA damage response that is required for efficient viral replication［J］.Journal of Virology，2011，85（23）：12547 12556.

［15］Vandergaast R，Schultz K L，Cerio R J，et al.Active depletion of host cell inhibitor-of-apoptosis IAP triggers apoptosis upon baculovirus DNA replication［J］.Journal of Virology，2011，85（16）：8348 8358.

［16］Seshagiri S，Miller L K.Baculovirus inhibitors of apoptosis（IAPs）block activation of Sf-caspase-1［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences U S A，1997，94（25）：13606 13611.

Expression analysis of apoptosis-related genes in Sf9 cells infected by recombinant AcMNPV-BmK IT

Fu Yuejun， Lin Taotao， Liang Aihua
（Institute of Biotechnology，Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering
of Ministry of Education，Shanxi University，Taiyuan030006，China）

We engineered an insect toxin gene fromButhus martensiiKarsch（BmK IT gene）into the genome of Ac MNPV（Autographa californicamulticapsid nucleopolyhedrovirus）in our previous study.The bioassay data indicated that the recombinant baculovirus Ac MNPV-BmK IT significantly enhanced the insecticidal activity.However，nothing is known about the apoptosis mechanism of Ac MNPV-BmK IT.In this study，Western blot and semi-quantitative PCR were used to analyze the effects of Ac MNPV-BmK IT on the expression of apoptosis-related genes，Sfp53 andiap2.The results showed that Ac MNPV-BmK IT increased the expression ofSfp53 and inhibited the expression ofiap2，which explained the enhanced insecticidal activity of Ac MNPV-BmK IT in cellular and molecular levels.

Ac MNPV-BmK IT； apoptosis；Sfp53；iap2

Q 781

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.004

2014 07 17

2014 09 01

國家自然科學基金（31272100）；山西省自然科學基金（2014011038-1）；山西省優秀青年學術帶頭人支持計劃

*通信作者 Tel：0351 7011499，E-mail：yjfu@sxu.edu.cn