桃蚜對噻蟲嗪代謝抗性機制研究

張平艷， 周小毛

（湖南農業大學農藥研究所，長沙 410128）

桃蚜對噻蟲嗪代謝抗性機制研究

張平艷， 周小毛*

（湖南農業大學農藥研究所，長沙 410128）

對桃蚜進行室內噻蟲嗪抗性品系篩選，選育至15代后抗性倍數達到75.6倍。對噻蟲嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）桃蚜的谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）、酸性磷酸酯酶（ACP）、堿性磷酸酯酶（ALP）、羧酸酯酶（CarE）、多功能氧化酶（MFO）O-脫甲基活性進行了比較，結果顯示：敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）的谷胱甘肽S-轉移酶比活力分別為3.127 5和3.215 9，差異不顯著，桃蚜抗性品系體內酸性磷酸酯酶、堿性磷酸酯酶、羧酸酯酶和多功能氧化酶O-脫甲基活性均顯著高于敏感品系，分別達到了1.57、2.10、6.12、2.03倍。表明桃蚜對噻蟲嗪抗性的產生與酸性磷酸酯酶、堿性磷酸酯酶、羧酸酯酶和多功能氧化酶O-脫甲基的活性相關。

桃蚜； 噻蟲嗪； 抗藥性； 解毒酶系

桃蚜［Myzus persicae（Sulzer）］又名煙蚜，屬同翅目蚜科，是多食性害蟲，寄主范圍廣，主要取食十字花科、菊科、茄科、豆科等50個科中的大約400多種植物［1］，同時也是植物病毒病的傳播媒介［2-3］。一直以來在桃蚜為害地區主要是使用化學農藥進行防治，殺蟲劑持續和高劑量的使用致使桃蚜對多種殺蟲劑產生了不同水平的抗藥性［4-7］，其中包括新一代硫代煙堿類殺蟲劑噻蟲嗪。噻蟲嗪是一種全新結構的第二代煙堿類高效低毒殺蟲劑，對害蟲具有胃毒、觸殺及內吸活性，用于葉面噴霧及土壤灌根處理。其施藥后迅速被根系內吸，并傳導到植株各部位，對刺吸式害蟲如蚜蟲、飛虱、葉蟬、粉虱等有良好的防效。有報道發現桃蚜對煙堿類殺蟲劑容易產生抗藥性［8］。

昆蟲體內多種代謝酶系對昆蟲產生抗藥性起著重要作用。磷酸酯酶是昆蟲體內重要的水解酶，主要可分為酸性磷酸酯酶（ACP）和堿性磷酸酯酶（ALP）兩種，酯酶對進入昆蟲體內的外源有毒物質起解毒代謝作用，同時也影響著害蟲抗藥性的產生［9］。羧酸酯酶是昆蟲抵御外源有毒物質的一種重要物質，在對殺蟲劑抗性中起著重要的作用，可以使昆蟲產生代謝抗性［10］。谷胱甘肽S-轉移酶是昆蟲體內的重要解毒代謝酶系，其與多種解毒機制密切相關［11］。多功能氧化酶（MFO）主要對有毒物質進行氧化代謝，其底物譜極廣，與許多害蟲的抗藥性產生相關［9，12］。本研究在室內篩選得到桃蚜噻蟲嗪抗性品系的基礎上，比較了桃蚜抗性和敏感品系4種解毒酶的活性差異，探討桃蚜對噻蟲嗪抗性形成的生理生化機制，旨在為防治桃蚜時合理使用殺蟲劑及抗性治理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

敏感品系：桃蚜（Myzus persicae）敏感品系于2006年10月采自湖南郴州市安仁縣熊蜂山自然保護區一野生桃樹上，該區域為自然保護區，方圓10 km內從未使用過化學農藥。室內使用自種蘿卜苗繼代飼養桃蚜（光照培養箱設定溫度為（25±1）℃，光周期L∥D＝16 h∥8 h，相對濕度70%～80%），作為噻蟲嗪相對敏感品系（THI-S）。

抗性品系：將采回的相對敏感品系用25%噻蟲嗪水分散粒劑汰選得到。根據毒力測定結果，用25%噻蟲嗪水分散粒劑配制好LC70濃度的藥液置于燒杯中，燒杯中放入適量棉花，將蘿卜苗莖浸入上述燒杯中24 h后飼養桃蚜，飼養1 d后將存活桃蚜用毛筆挑至新種蘿卜苗上飼養，采用此方法進行繼代飼養和汰選，每次處理濃度控制在殺死70%左右成蚜，根據生測結果適當提高用藥濃度，每代進行一次毒力測定。以幾率值法計算毒力方程，LC50及95%置信區間。經過對桃蚜相對敏感品系15代汰選后得到桃蚜相對抗性品系（THI-R）。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 供試藥劑

98%噻蟲嗪（thiamethoxam）原藥（瑞士先正達作物保護有限公司），用于生物測定試驗；25%噻蟲嗪水分散粒劑（瑞士先正達作物保護有限公司），用于抗性篩選。

1.2.2 主要試劑

乙酸-α-萘酯、乙酸-β-萘酯、對α-萘酚、還原型L-谷胱甘肽（GSH）、對硝基苯和NADPH均為Sigma公司產品；硝基苯酚（NO2C6H4OH），上海三愛思試劑有限公司；對硝基磷酸二鈉（C6H4NNa2O6P· 6H2O），Merck公司；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），北京鼎國生物技術有限公司；對硝基苯甲醚（C7H7NO3），上海三愛思試劑有限公司；牛血清白蛋白Albumin，上海伯奧生物科技有限公司；考馬斯亮藍G-250，Fluka公司。本試驗提取和酶學測定部分所用試劑為分析純試劑。

1.2.3 主要儀器

UV-2201型紫外分光光度計，日本島津公司，Beckman低溫離心機，德國貝克曼公司。

1.3 蘿卜苗種植方法

將蘿卜種子浸泡水中5 h后再使用75%百菌清500倍液浸泡0.5 h，種子用清水沖洗干凈后均勻種植在未含農藥的濕潤土壤中，置于光照培養箱中，培養溫度為（25±1）℃，相對濕度55%，光周期L∥D＝16 h∥8 h，每3～5 d種植一批蘿卜苗。

1.4 生物測定方法

采用葉柄內吸法，將花椰菜（Brassica oleraceavar.botrytisLinn.）葉剪下后立即將葉柄浸入系列濃度藥液（0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 mg/L）中，24 h后將帶藥葉片剪取d＝5.5 cm的圓片，先向培養皿中倒入12 g/L的瓊脂3～5 mm用以保濕，待瓊脂冷卻后將葉片放置在d＝6 cm的培養皿內，每個培養皿中放入30頭大小一致的桃蚜，用保鮮膜將培養皿封口，封口膜上針扎20～30個小孔，所有培養皿放入人工氣候箱內飼養，飼養1 d后觀察結果，毛筆輕觸桃蚜，不動者視為死亡。每個處理設置4次重復。用DPS V12.01求出毒力回歸方程、標準誤、LC50及其置信區間。

1.5 蛋白質含量的測定

參照考馬斯亮藍G-250法［13］，考馬斯亮藍染色液的配制：取考馬斯亮藍G-250 100 mg加入到50 mL 95%C2H5OH中，再加100 mL含量為85%的H2PO4后用蒸餾水定容至1 L。BSA（牛血清蛋白）標準蛋白液配制：準備6支試管洗凈并干燥，依次用移液器加入BSA液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL后用蒸餾水定容至1 mL；每支試管中加入3 mL考馬斯亮藍染色液；將加液后的試管放入恒溫水浴鍋（25～30℃），20 min，使用紫外分光光度計測定A595。酶蛋白測定時，以酶液代替BSA標準液。以光密度值為縱坐標，以蛋白質濃度為橫坐標，制作標準曲線。

1.6 桃蚜谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）活性測定

選取無翅成蚜抗性和敏感品系各100頭放入勻漿器中，向勻漿器中加入PBS（66 mmol/L，p H＝7.0）緩沖液4 mL冰上勻漿，勻漿液于高速低溫離心機（4℃，12 000 r/min，15 min）離心，取上清稀釋10倍4℃保存，作為酶源備用。谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）比活力測定參照Habig等的方法［14］稍有改進。反應混合液中含有酶液0.2 mL，PBS緩沖液（66 mmol/L，p H＝7.0）2.4 mL，GSH水溶液（50 mmol/L）0.3 mL，2，4-二硝基氯苯（0.03 mol/L）0.1 mL，27℃水浴5 min，測定A340，每個樣品重復3次取平均值，以每分鐘催化生成1μmol產物為1個活性單位，按照以下公式計算酶活力：

GSTs活力單位（μmol/min）＝（ΔA340·v）/（ε·L）

注：ΔA340為每分鐘光吸收的變化值，v是酶促反應的體積，ε為產物消光系數［0.009 6 mol/（L·cm）］，L是比色杯的光程（1 cm）。按0.009 6 mol（L·cm）的消光系數計算谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）的比活力，單位為mmol/（mg·min）。

1.7 桃蚜磷酸酯酶活性測定

1.7.1 酸性磷酸酯酶（ACP）活性測定

參照Bessey的方法［15］并稍有改進，以對硝基苯酚為標準物質制作標準曲線。選取無翅成蚜抗性和敏感品系各100頭放入勻漿器中，加入醋酸緩沖液（p H＝4.6，0.2 mol/L）1 mL冰上勻漿，勻漿液于高速低溫離心機（4℃，12 000 r/min，15 min）離心，取上清液4℃保存作為酶源備用。以對硝基苯基磷酸二鈉作為反應底物（終濃度為0.75 mmol/L），酶液用量分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，反應總體積用0.2 mol/L醋酸緩沖液配至3.0 mL，混合后37℃下水浴0.5 h，然后加入0.2 mol/L NaOH 2.0 m L終止反應，室溫靜置10 min測定A400，每個樣品重復3次取平均值，根據制作的標準曲線和酶源蛋白含量的測定結果計算酸性磷酸酯酶（ACP）酶活性，以比活力［μmol/（mg·30 min）］表示。

1.7.2 堿性磷酸酯酶（ALP）活性

測定方法與1.7.1酸性磷酸酯酶（ACP）活性測定方法基本相同，堿性磷酸酯酶活性測定使用巴比妥緩沖液（0.4 mol/L，p H＝9.6）代替醋酸緩沖液（0.2 mol/L，p H＝4.6）。

1.8 羧酸酯酶（Car E）活性測定

選取無翅成蚜抗性和敏感品系各100頭放入勻漿器中，向勻漿器中加入PBS（0.04 mmol/L，p H＝7.0）緩沖液4 m L冰上勻漿，勻漿液于高速低溫離心機（4℃，12 000 r/min，15 min）離心，取上清液稀釋25倍4℃保存，作為酶源備用。桃蚜羧酸酯酶（CarE）比活力測定參照van Asperen的方法［16］并稍有改進。反應混合液中含有羧酸酯酶酶液1 mL，α-醋酸萘酯（3×10－4mol/L）5 mL，30℃下水浴0.5 h，然后向反應體系中加入顯色劑1 mL，室溫靜置0.5 h后測定A600，每個樣品重復3次取平均值。根據制作的標準曲線和酶源蛋白含量的測定結果計算羧酸酯酶（CarE）酶活性，以比活力［μmol/（mg·min）］表示。

1.9 多功能氧化酶（MFO）O-脫甲基活性測定

參照Hung等的方法［17］并稍有改進。選取無翅成蚜抗性和敏感品系各100頭放入勻漿器中，向勻漿器中加入PBS（0.2 mmol/L，p H＝7.8）緩沖液1.5 mL冰上勻漿，勻漿液于高速低溫離心機（4℃，10 000 r/min，15 min）離心，取上清液4℃保存，作為酶源備用。以對硝基苯甲醚為底物，在多功能氧化酶（MFO）O-脫甲基的作用下，生成對硝基苯酚鈉，以對硝基酚制作標準曲線。反應體系含酶液1 mL、1.0 mmol/L NADPH（緩沖液配制）0.5 mL、0.1 mmol/L對硝基苯甲醚（緩沖液配制）0.1 mL和緩沖液2.5 mL，在30℃水浴0.5 h然后加1.0 mmol/L的HCl 1 mL終止反應。向試管中加入氯仿5 mL進行萃取，待分層后從氯仿層中移取3 m L到另一試管內，加入0.5 mol/L的NaOH 3 m L萃取。取NaOH溶液層2 mL于比色皿中，測定A400值，根據對硝基苯酚標準曲線和酶源蛋白質含量，將A值換算成比活力μmol（mg·30 min），每個樣品重復3次取平均值。

2 結果與分析

2.1 生物測定結果

采用葉柄內吸法分別測定桃蚜敏感品系（THIS）和抗性品系（THI-R）對噻蟲嗪的敏感性，測定結果見表1。

表1 桃蚜敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）對噻蟲嗪的敏感性Table 1 Susceptibility of resistant and susceptible strains ofMyzus persicaeto thiamethoxam

由表1中數據可見，從湖南省郴州市安仁縣熊蜂山自然保護區野生桃樹上采集的桃蚜品系對噻蟲嗪敏感，毒力回歸方程中斜率大于2，表明該品系的同質性較高，該品系可以作為相對敏感品系。該敏感品系分出一部分用25%噻蟲嗪可濕性粉劑進行抗性選育，經過15代繼代選育，經生物測定數據可以看出已經產生了75.6倍的抗性，達到了高水平抗性。

2.2 桃蚜噻蟲嗪抗性和敏感品系谷胱甘肽S-轉移酶活性測定結果

對桃蚜噻蟲嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）體內的谷胱甘肽S-轉移酶活性進行測定并比較分析，結果見表2。敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）的谷胱甘肽S-轉移酶比活力分別為3.127 5和3.215 9 mmol/（mg·min），差異不顯著，表明桃蚜對噻蟲嗪產生抗性與谷胱甘肽S-轉移酶活性不相關。

2.3 桃蚜噻蟲嗪抗性和敏感品系磷酸酯酶活性測定結果

桃蚜噻蟲嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）體內磷酸酯酶的比活力測定結果見表3。敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）酸性磷酸酯酶的比活力分別是105.273 6和164.932 7μmol/（mg ·30 min）。抗性品系（THI-R）酸性磷酸酯酶的比活力是敏感品系（THI-S）的1.57倍，差異達到顯著水平。敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）堿性磷酸酯酶的比活力分別是1.686 3和3.548 1μmol/（mg ·30 min）。抗性品系（THI-R）堿性磷酸酯酶的比活力是敏感品系（THI-S）的2.10倍，差異達到顯著水平。說明桃蚜對噻蟲嗪產生抗性可能與酸性磷酸酯酶和堿性磷酸酯酶均有關。

表2 桃蚜噻蟲嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）谷胱甘肽S-轉移酶活性比較1）Table 2 Comparison of glutathioneS-transferase activity between thiamethoxam-susceptible（THI-S）and thiamethoxam-resistant（THI-R）strains ofMyzus persicae

表3 桃蚜噻蟲嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）磷酸酯酶比活力Table 3 Comparison of phosphoesterase activity between THI-Sand THI-R strains ofMyzus persicae

2.4 桃蚜噻蟲嗪抗性和敏感品系羧酸酯酶測定結果

桃蚜噻蟲嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）體內羧酸酯酶的比活力測定結果見表4，敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）羧酸酯酶的比活力分別是0.463 5和2.837 6μmol/（mg· min）。抗性品系（THI-R）羧酸酯酶的比活力是敏感品系（THI-S）的6.12倍，差異達到顯著水平。

表4 桃蚜敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）羧酸酯酶比活力Table 4 Comparison of carboxylesterase activity between THI-Sand THI-R strains ofMyzus persicae

2.5 桃蚜噻蟲嗪抗性和敏感品系多功能氧化酶（MFO）O-脫甲基活性測定結果

通過測定和比較桃蚜噻蟲嗪敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）體內的多功能氧化酶（MFO）O-脫甲基比活力（表5），結果表明兩個品系的比活力差異顯著，THI-R體內多功能氧化酶（MFO）O-脫甲基比活力是THI-S的2.03倍，說明桃蚜對噻蟲嗪的抗性可能與多功能氧化酶（MFO）O-脫甲基活性有關。

表5 桃蚜敏感品系（THI-S）和抗性品系（THI-R）多功能氧化酶O-脫甲基比活力Table 5 Comparison of MFOO-demethylation activity between THI-Sand THI-R ofMyzus persicae

3 討論

害蟲抗藥性產生主要涉及解毒酶代謝能力增強導致的代謝抗性和殺蟲劑作用靶標敏感性降低導致的靶標抗性兩方面［18］。楊煥青等發現吡蟲啉抗性達到24.38倍的棉蚜體內谷胱甘肽S-轉移酶的比活力是敏感品系的1.57倍［19］；史曉斌等發現對吡蟲啉抗性達到42.19倍的棉蚜體內谷胱甘肽S-轉移酶的比活力是敏感品系的1.58倍［20］，谷胱甘肽S-轉移酶活力增加較緩慢；噻蟲嗪作為第二代煙堿類高效低毒殺蟲劑，筆者研究發現桃蚜敏感品系和抗性品系的谷胱甘肽S-轉移酶比活力分別為3.127 5和3.215 9，差異不顯著，桃蚜對噻蟲嗪產生抗性與谷胱甘肽S-轉移酶不相關。

害蟲體內水解酶數量與其他變化都是導致害蟲抗藥性的重要因子，帥霞等發現桃蚜對高效氯氰菊酯抗性品系的形成與堿性磷酸酯酶活性增強相關［9］。本研究發現桃蚜抗性品系中的酸性磷酸酯酶和堿性磷酸酯酶活性顯著高于敏感品系，表明酸性磷酸酯酶和堿性磷酸酯酶是桃蚜對噻蟲嗪產生抗藥性的重要因素。

細胞色素P450主要依靠微粒體多功能氧化酶起作用，且該酶存在非常廣泛底物的同工酶系，對進入害蟲體內的有毒物質通過氧化代謝進行解毒。研究發現羧酸酯酶和細胞色素P450解毒代謝增強是害蟲對煙堿類殺蟲劑產生抗性的重要機制。邱高輝等發現用吡蟲啉室內篩選麥長管蚜種群至25.22倍時，低水平抗性的代謝機理是多功能氧化酶和羧酸酯酶活力增強［21］；羧酸酯酶在昆蟲代謝藥物的過程中起著重要的作用［22］，隨著棉蚜對吡蟲啉抗性的增加，棉蚜體內的解毒酶活力逐漸增加，其中羧酸酯酶增長較快；利用PBO進行抑制試驗發現：PBO對吡蟲啉有顯著增效作用，推測多功能氧化酶活力升高是棉蚜對吡蟲啉產生抗性的機理之一［20］。桃蚜對有機磷類、氨基甲酸酯類、菊酯類藥劑和吡蟲啉抗藥性的產生主要是其多功能氧化酶活性提高所引起［23-25］。本研究發現抗性品系羧酸酯酶、多功能氧化酶（MFO）O-脫甲基的比活力分別是敏感品系的6.12倍和2.03倍，說明羧酸酯酶、多功能氧化酶（MFO）O-脫甲基活性升高與桃蚜對噻蟲嗪的抗性密切相關。

單因子抗性發展速度快于多因素引起的抗性發展速度［26］，本研究通過室內選育建立桃蚜抗噻蟲嗪種群屬于單因子抗性，可以明確桃蚜對噻蟲嗪抗性發展趨勢，進而合理施藥提高防治效果，延緩抗藥性的發展；根據試驗結果發現桃蚜對噻蟲嗪的抗藥性與4種解毒代謝酶相關，使用殺蟲劑時可以適當加入增效劑，如增效磷、增效醚等起到增效效果。本文僅在生化水平初步研究了桃蚜對噻蟲嗪代謝的抗性機制，有待進一步在分子水平進行更深入系統的研究。

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Metabolic mechanism of resistance to thiamethoxam inMyzus persicae

Zhang Pingyan， Zhou Xiaomao
（Institute of Pesticide Research，Hunan Agricultural University，Changsha410128，China）

Resistance screening ofMyzus persicae（Sulzer）to thiamethoxam was conducted in the laboratory.After 15 generations of selection，the resistance index ofM.persicaeto thiamethoxam was 75.6 folds.The activities of GSTs，ACP，ALP，CarE and MFOO-demethylation were tested in both sensitive（THI-S）and resistant（THIR）biotypes ofM.persicae.The results showed that the activity of GSTs in THI-Sand THI-R had no significant difference，with specific activity indexes of 3.127 5 and 3.215 9，respectively.However，the activities of ACP，ALP，CarE and MFOO-demethylation in THI-R were higher than those in THI-S，with indexes of 1.57，2.10，6.12 and 2.03，respectively.These results indicated that the resistance ofM.persicaeto thiamethoxam was related to the activities of ACP，ALP，CarE and MFOO-demethylation.

Myzus persicae； thiamethoxam； resistance； detoxification enzyme system

S 481.4

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.007

2014 01 16

2014 05 21

國家自然科學基金項目（31071716）；教育部新世紀優秀人才支持計劃項目（NCET-10 0163）；公益性行業（農業）科研專項（201203038）

*通信作者 E-mail：zhouxm1972@126.com