銅綠麗金龜雌蟲觸角全長(zhǎng)cDNA文庫的構(gòu)建及質(zhì)量分析

趙 瑩， 尹 姣， 李克斌， 曹雅忠， 仵均祥

（1.農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，楊凌 712100；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)

銅綠麗金龜雌蟲觸角全長(zhǎng)cDNA文庫的構(gòu)建及質(zhì)量分析

趙 瑩1，2， 尹 姣2， 李克斌2， 曹雅忠2， 仵均祥1*

（1.農(nóng)業(yè)部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，楊凌 712100；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

為了研究銅綠麗金龜（Anomala corpulentaMotschulsky）成蟲嗅覺相關(guān)蛋白的功能，本文以銅綠麗金龜雌成蟲觸角為原始材料提取總RNA，利用SMART技術(shù)構(gòu)建了銅綠麗金龜雌蟲觸角全長(zhǎng)cDNA文庫。經(jīng)測(cè)定，原始文庫滴度為6.74×106pfu/mL，擴(kuò)增后的文庫滴度為1.08×1010pfu/mL，文庫重組率為98.98%。隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆，通過菌液PCR檢測(cè)得知文庫插入片段的大小在0.5～2.0 kb之間，片段平均長(zhǎng)度為1.0 kb左右。經(jīng)過菌液PCR并測(cè)序篩選cDNA文庫，本試驗(yàn)獲得了兩條編碼氣味結(jié)合蛋白的全長(zhǎng)基因序列AcorOBP1和AcorOBP2。以上數(shù)據(jù)表明，已獲得高質(zhì)量的銅綠麗金龜觸角全長(zhǎng)cDNA文庫，并篩選、克隆獲得了氣味結(jié)合蛋白基因序列。這為進(jìn)一步研究觸角內(nèi)氣味結(jié)合蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

銅綠麗金龜； 觸角； 全長(zhǎng)cDNA文庫

金龜子屬于鞘翅目、金龜總科，是我國(guó)農(nóng)林生產(chǎn)中的重要害蟲，目前全世界已知約2萬種，中國(guó)已報(bào)道的約1 800種［1］。其幼蟲蠐螬為害多種植物，主要取食植物地下根、莖部分，生活隱蔽，分布廣，食量大，食性雜，難以防治，是我國(guó)地下害蟲中的最大類群。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，植物受害地下部分中86%是由蠐螬為害造成的［2］。蠐螬咬斷幼苗根莖部，影響農(nóng)作物幼苗的生長(zhǎng)，造成產(chǎn)量和質(zhì)量的下降。例如，蠐螬為害花生致使花生果實(shí)秕仁、空殼率增加，花生田大面積減產(chǎn)甚至絕收［3］。金龜子成蟲主要在地上活動(dòng)，取食林木、果樹以及農(nóng)作物的葉片、花蕾等。銅綠麗金龜（Anomala corpulenta）是我國(guó)金龜子中的重要優(yōu)勢(shì)種群［4］，主要取食榆樹、楊樹、柳樹、櫻花、葡萄、海棠、杏、銀杏木、月季等植物葉片，為害嚴(yán)重時(shí)，導(dǎo)致植物僅留葉脈，食光葉片后又遷移到其他苗木上繼續(xù)為害［5］，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響農(nóng)林果業(yè)的發(fā)展。

全長(zhǎng)cDNA文庫的構(gòu)建、測(cè)序和功能注釋是了解生物結(jié)構(gòu)和功能的重要方法之一［6］，在分離、克隆、篩選新基因以及基因功能研究等方面具有重要作用。SMART（Switching Mechanism At 5′end of the RNA Transcript）技術(shù)由美國(guó)Clontech公司推出［7］，是目前研究技術(shù)比較成熟，應(yīng)用最為廣泛的全長(zhǎng)cDNA文庫構(gòu)建方法。SMART技術(shù)在反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA時(shí)，事先加入3′末端帶Oligo（dG）的SMART引物，以mRNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶（Power ScriptTMReverse Transcriptase）的作用下合成全長(zhǎng)第一鏈cDNA；此外，在目的基因與載體連接階段，僅僅對(duì)目的ds cDNA進(jìn)行SfiⅠ單酶切，就可以得到兩個(gè)黏性末端不同的cDNA，這樣目的片段就能夠定向插入特定的載體中，大大提高了文庫的陽性克隆率［8］。SMART法構(gòu)建文庫需要的mRNA量少［9-10］，且操作簡(jiǎn)便、快速，降低了mRNA降解的幾率，最終獲得具有較高全長(zhǎng)序列比例的cDNA文庫。

觸角是昆蟲感受外界環(huán)境的主要器官，在昆蟲尋找食物、尋求配偶或選擇生殖場(chǎng)所的過程中起到至關(guān)重要的作用。金龜子觸角上的嗅覺感器居多，主要為板形感器和錐形感器；對(duì)化學(xué)氣味具有選擇性，而且雌雄兩性間常常存在嗅覺差異［11］。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)昆蟲的氣味結(jié)合蛋白在表達(dá)時(shí)顯示幾乎完全的性不關(guān)聯(lián)［12-15］；但是有些昆蟲雌蟲對(duì)植物揮發(fā)物更敏感，這可能是為了更有利于雌蟲選擇產(chǎn)卵寄主［16］。另外，雌蟲在種群繁衍中擔(dān)負(fù)著生殖后代的生物本能。所以我們選擇了構(gòu)建銅綠麗金龜雌蟲觸角全長(zhǎng)cDNA文庫，這樣一方面可能一次性永久保留更多的基因資源，另一方面為進(jìn)一步順利篩選、克隆以及表達(dá)嗅覺蛋白，從分子水平深入研究銅綠麗金龜嗅覺機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試蟲源

試蟲采集地點(diǎn)為河南省洛陽市郊，用燈光誘捕法捕捉銅綠麗金龜成蟲，在室內(nèi)將雌蟲與雄蟲分開，在冰上取其觸角，放入1.5 mL無菌離心管中，每管收集10對(duì)觸角，在液氮中迅速冷凍，最后將離心管放入－80℃超低溫冰箱中冷藏備用。

1.1.2 主要試劑及來源

RNeasy Plus Mini Kit購(gòu)自Qiagen公司。SMARTTMcDNA Library Construction Kit（Cat.No. 634901）購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，噬菌體包裝試劑盒MaxPlaxTMLambda Packaging Extracts為美國(guó)Epicentre試劑盒，二甲苯青購(gòu)自Sigma公司，LATaq酶、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自TaKaRa公司，抗生素、X-gal、IPTG購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。引物合成與PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

90 mm LB/MgSO4平板、150 mm LB/MgSO4平板：在100 mL LB液體培養(yǎng)基中加入1.5 g瓊脂粉，再加入1 m L濃度為1 mol/L的MgSO4溶液，混勻后高溫滅菌。滅菌結(jié)束后將培養(yǎng)基平鋪于若干個(gè)直徑為90 mm（簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)B平板A）或150 mm（簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)B平板B）的無菌平板中，超凈臺(tái)凝固后，在4℃條件下保存。

LB/Amp平板：在100 mL LB液體培養(yǎng)基中加入1.5 g瓊脂粉，高溫滅菌，待培養(yǎng)基溫度降至50℃時(shí)加入100μL濃度為50 mg/mL的Amp，迅速混合均勻后將培養(yǎng)基平鋪于若干個(gè)直徑為90 mm無菌平板中，超凈臺(tái)凝固后，在4℃條件下保存（簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)B平板C）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取

用無水乙醇燃燒處理研缽、研杵之后用液氮迅速冷卻。從80℃超低溫冰箱中取出100對(duì)雌蟲觸角放入液氮中備用。將觸角放入含有液氮的研缽中，迅速研磨直至觸角呈粉末狀。按照Qiagen公司RNeasy Plus Mini Kit說明書要求提取總RNA。取2μL樣品，用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量，并用核酸蛋白分析儀檢測(cè)其濃度。

1.2.2 雙鏈cDNA合成

按照SMARTTMcDNA Library Construction Kit試劑盒說明書，以3μL總RNA為模板，以SMRATⅣ寡聚核苷酸和CDSⅢ/3′-PCR為引物，在SMART ScribeTMMMLV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

再以cDNA為模板，在CDSⅢ/3′-PCR引物和5′-PCR引物引導(dǎo)下，經(jīng)過LD-PCR（long distance polymerase chain reaction），合成雙鏈cDNA（ds cDNA）。反應(yīng)程序?yàn)?5℃1 min；95℃15 s、68℃6 min，20個(gè)循環(huán)；結(jié)束后4℃保存。取2μL產(chǎn)物，用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效率，其余產(chǎn)物在－20℃保存。

1.2.3 蛋白酶K消化

在0.5 mL離心管中加入50μL ds cDNA和2μL蛋白酶K，混勻后45℃孵育20 min；孵育結(jié)束后加入50μL去離子水，混勻，再加入100μL體積比為25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶異戊醇，輕柔顛倒，14 000 r/min離心5 min；將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入100μL體積比為24∶1的氯仿∶異戊醇，輕柔顛倒，14 000 r/min離心5 min；取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入3 mol/L醋酸鈉10μL、20μg/μL糖原1.3μL、95%乙醇260μL，14 000 r/min離心20 min，棄上清液，用80%乙醇100μL洗滌沉淀，待沉淀干燥后，加入79μL去離子水溶解沉淀。

1.2.4SfiⅠ酶切

將已獲得的ds cDNA進(jìn)行SfiⅠ酶切，酶切后加入2μL 1%的二甲苯青，為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.2.5 cDNA分級(jí)分離

按試劑盒說明書要求準(zhǔn)備16個(gè)1.5 mL離心管。將CHROMA SPIN-400分級(jí)分離柱內(nèi)基質(zhì)搖勻，使凝膠基質(zhì)完全懸浮，去除柱子內(nèi)的氣泡，移走底蓋使柱內(nèi)緩沖液流盡。沿柱子內(nèi)壁加入700μL圓柱緩沖液，待緩沖液排盡后，加入用二甲苯青染過色的cDNA樣品，靜置1 min，使樣品完全吸附在基質(zhì)表面，用100μL圓柱緩沖液洗滌柱子，待無緩沖液流出后，加入600μL圓柱緩沖液，按每管1滴收集樣品。每管取3μL樣品，用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。收集前4管有ds cDNA條帶的原樣品液，匯集于一支新的離心管中，加入1/10回收樣品液體積的3 mol/L醋酸鈉、20μg/μL糖原1.3μL和2.5倍回收樣品液體積的95%乙醇，在－20℃條件下過夜?jié)饪s，離心，棄上清液，用7μL去離子水溶解沉淀。

1.2.6 cDNA與λTriplE×2噬菌體載體連接

為了獲得cDNA與載體的最優(yōu)連接比例，使用3個(gè)比例的連接體系，16℃過夜連接。反應(yīng)體系如表1所示。

1.2.7 噬菌體包裝

室溫解凍噬菌體包裝提取物，向連接產(chǎn)物中加入25μL噬菌體包裝提取物，30℃孵育90 min，反應(yīng)結(jié)束后再加入25μL噬菌體包裝提取物，30℃孵育90 min。孵育結(jié)束后分別加入1×λ稀釋緩沖液500μL、氯仿25μL，渦旋混勻，將噬菌體溶液保存在4℃冰箱中。

1.2.8 文庫質(zhì)量的鑒定

未擴(kuò)增文庫滴度：過夜培養(yǎng)E.coliXL1-Blue菌，A600達(dá)到2.0后，離心棄上清液，用7.5 mL濃度為10 mmol/L的MgSO4溶液重懸菌體。噬菌體溶液用1×λ稀釋緩沖液稀釋，比例分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20，分別取1μL稀釋后的噬菌體溶液與200μL重懸菌液，混勻，37℃培養(yǎng)10 min，加入2 mL融化的頂層瓊脂，混勻后平鋪于LB平板A，37℃過夜培養(yǎng)。

文庫滴度（pfu/mL）＝（噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)× 103）/涂板噬菌體體積（μL）

重組率測(cè)定：過夜培養(yǎng)E.coliXL1-Blue菌，離心收集菌體，用5 mL濃度為10 mmol/L的MgSO4溶液重懸菌體。添加X-gal與IPTG到融化的頂層瓊脂中，每2 mL融化的頂層瓊脂使用X-gal（100 mmol/L）、IPTG（100 mmol/L）各50μL，將細(xì)菌培養(yǎng)物、包裝后噬菌體溶液和2 m L融化的頂層瓊脂混勻，快速平鋪于LB平板A上，37℃培養(yǎng)6～18 h，直至顯藍(lán)斑。

1.2.9 擴(kuò)增文庫的建立

根據(jù)未擴(kuò)增文庫滴度估算文庫擴(kuò)增時(shí)所需LB平板B的數(shù)目。例如，150 mm平板有（6～7）×104個(gè)克隆，則文庫1×106個(gè)克隆則需要20個(gè)平板。

過夜培養(yǎng)E.coliXL1-Blue菌，A600達(dá)到2.0后，離心棄上清液，用7.5 mL濃度為10 mmol/L的MgSO4溶液重懸菌體。將細(xì)菌培養(yǎng)物、包裝后噬菌體溶液和4 mL融化的頂層瓊脂三者混勻，平鋪于LB平板B，37℃培養(yǎng)6～18 h。向長(zhǎng)出噬菌斑的平板中加入12 mL 1×λ稀釋緩沖液，4℃冰箱中過夜放置。取出冰箱中的平板，50 r/min室溫孵育1 h，將平板內(nèi)的噬菌體溶液收集到50 mL離心管中，加入10 mL氯仿，渦旋震蕩2 min，7 000 r/min離心10 min，收集上清液到新的50 mL離心管中，4℃保存擴(kuò)增后文庫（長(zhǎng)期保存文庫則需要加終濃度為7%的DMSO，并保存在－70℃超低溫冰箱）。

1.2.10 噬菌體文庫向質(zhì)粒文庫的轉(zhuǎn)化

過夜培養(yǎng)E.coliBM 25.8菌，A600達(dá)1.1～1.4時(shí)，加入100μL濃度為1 mol/L的MgCl2溶液。將500μL細(xì)菌培養(yǎng)物與200μL噬菌體溶液混勻，31℃孵育1 h；再加入1 mL LB培養(yǎng)基，31℃，225 r/min條件下培養(yǎng)1 h。取1～10μL感染細(xì)胞懸浮液涂于LB平板C，31℃過夜培養(yǎng)。

1.2.11 插入片段大小檢測(cè)及序列篩選

插入片段大小檢測(cè)：隨機(jī)挑取24個(gè)單菌落，以載體上已知片段為引物序列，進(jìn)行菌液PCR。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃4 min；94℃45 s，58℃45 s，72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后取3μL產(chǎn)物用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余產(chǎn)物－20℃保存。依據(jù)此步驟，將PCR獲得的產(chǎn)物送生工公司測(cè)序，根據(jù)反饋的信息，在GenBank上篩選目的基因片段。引物序列為：

上游引物：5′-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3′；下游引物：5′-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠麗金龜觸角總RNA的提取質(zhì)量檢測(cè)

1.1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。28 S與18 S條帶清晰，而5 S無明顯條帶，且拖帶現(xiàn)象不明顯。經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測(cè)，A260/A280值為2.16，A260/A230值為2.42，總RNA濃度為395 ng/μL，說明總RNA質(zhì)量很高，可用于cDNA文庫的構(gòu)建。

2.2 雙鏈的合成

如圖2、圖3所示，反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA與LD-PCR后形成的ds cDNA均為彌散的條帶，其中有幾條比較明顯的條帶。

圖1 銅綠麗金龜觸角總RNAFig.1 The total RNA from the antennae ofAnomala corpulenta

圖2 銅綠麗金龜觸角cDNA第一鏈Fig.2 First-strand cDNA from the antennae ofAnomala corpulenta

2.3 cDNA分級(jí)分離檢測(cè)

經(jīng)過柱層析分離，共收集了16管cDNA片段樣品，電泳檢測(cè)如圖4所示，1～6管幾乎沒有ds cDNA，7～10號(hào)管有明顯大于500 bp的ds cDNA條帶，11～16管無明顯ds cDNA條帶。收集7～10管cDNA樣品到新的離心管中，用于后續(xù)連接試驗(yàn)。

圖3 銅綠麗金龜觸角ds cDNAFig.3 The ds cDNA from the antennae ofAnomala corpulenta

2.4 cDNA文庫的質(zhì)量鑒定

2.4.1 文庫庫容量及重組率的檢測(cè)

根據(jù)SMART試劑盒提供的測(cè)定方法，測(cè)得原始文庫的滴度為6.74×106pfu/m L。擴(kuò)增之后文庫的滴度為1.08×1010pfu/m L。藍(lán)白斑篩選得克隆重組率為98.98%，是高質(zhì)量的cDNA文庫。

2.4.2 文庫插入片段大小檢測(cè)

從LB平板C上隨機(jī)挑取了24個(gè)單菌落，經(jīng)1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，插入片段分布在500～2 000 bp范圍內(nèi)，其中以500～1 000 bp大小的片段為主。

圖4 銅綠麗金龜觸角雙鏈cDNA分級(jí)圖Fig.4 Separation of ds cDNA from the antennae ofAnomala corpulenta

圖5 銅綠麗金龜觸角cDNA文庫部分PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果Fig.5 PCR detection of partial clones of cDNA library from antennae ofAnomala corpulenta

2.5 篩選結(jié)果

根據(jù)測(cè)序公司反饋的序列信息，在GenBank上利用BLAST篩選目的片段。經(jīng)序列比對(duì)，獲得了銅綠麗金龜氣味結(jié)合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）基因全長(zhǎng)序列，并推導(dǎo)獲得氨基酸序列。如圖6所示。推導(dǎo)的氨基酸序列位于核苷酸序列之下，方框標(biāo)注的為保守的半胱氨酸位點(diǎn)。OBP1全長(zhǎng)608 bp，開放閱讀框長(zhǎng)度為405 bp，編碼135個(gè)氨基酸，其中前19個(gè)氨基酸殘基為預(yù)測(cè)的信號(hào)肽，預(yù)測(cè)分子量大小為14.816 ku，等電點(diǎn)為4.43。OBP2全長(zhǎng)602 bp，開放閱讀框長(zhǎng)度為459 bp，編碼153個(gè)氨基酸，其中前20個(gè)氨基酸殘基為預(yù)測(cè)的信號(hào)肽，預(yù)測(cè)分子量大小為12.906 ku，等電點(diǎn)為4.33。昆蟲的氣味結(jié)合蛋白OBPs普遍具有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，基本結(jié)構(gòu)模型為Cys-X（20 66）-Cys-X（3）-Cys-X（21 43）-Cys-X（8 14）-Cys-X（8 6）-Cys，X代表每個(gè)半胱氨酸之間間隔的氨基酸殘基數(shù)，其中第2個(gè)半胱氨酸與第3個(gè)半胱氨酸之間總是間隔3個(gè)氨基酸殘基，第5個(gè)半胱氨酸與第6個(gè)半胱氨酸之間總是間隔8個(gè)氨基酸殘基。根據(jù)兩個(gè)OBPs的半胱氨酸位點(diǎn)的數(shù)量和位置，可知這兩個(gè)蛋白的氨基酸序列屬于經(jīng)典模型OBPs。

圖6 OBP1和OBP2核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.6 Nucleotide and deduced amino acid sequence of OBP1 and OBP2

通過http：∥us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl，對(duì)已獲得的氣味結(jié)合蛋白開放閱讀框進(jìn)行在線疏水性分析。從圖7中我們可以看出，兩條基因序列編碼的氨基酸N-端都有一段疏水的氨基酸殘基，即信號(hào)肽，而且這兩條氨基酸序列都能形成明顯的疏水腔。

圖7 AcorOBP1和AcorOBP2氨基酸序列疏水性分析Fig.7 Hydrophobic analysis for the deduced amino acid sequences of the AcorOBP1 and AcorOBP2

圖8 銅綠麗金龜OBPs序列聯(lián)配Fig.8 Alignment of amino acid sequences of AcorOBPs

對(duì)獲得的銅綠麗金龜OBPs兩條氨基酸序列進(jìn)行序列聯(lián)配，如圖8所示，序列間相似度很低，氨基酸序列一致性僅為16.4%，蛋白之間的分化度很高。此外，銅綠麗金龜OBPs與其他金龜子OBPs進(jìn)行序列聯(lián)配（圖9），發(fā)現(xiàn)銅綠麗金龜OBP1與其他金龜子OBP1或PBP1的同源性較高，序列間相似度均在80%以上，表明在不同種之間有較高的保守性。而銅綠麗金龜OBP2分化程度較高，與小栗鰓金龜OBP2的相似度為88%，與大黑鰓金龜OBP2的相似度為54%，與暗黑鰓金龜?shù)南嗨贫葹?3%。

通過MEGA 4.0構(gòu)建了部分鞘翅目昆蟲OBPs的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖10），1 000次重復(fù)結(jié)果，結(jié)果表明34個(gè)OBPs分成2個(gè)大的分支。OBP1與OBP2序列同源性較低，在進(jìn)化樹中兩者位于不同的兩個(gè)分支中，并且距離較遠(yuǎn)，這表明他們屬于不同的亞群，并且可能在昆蟲中所行使的功能不同。

圖10 銅綠麗金龜OBPs與其他鞘翅目昆蟲OBPs的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 Phylogenetic tree of AcorOBPs and other OBPs from Coleoptera insects

3 結(jié)論與討論

3.1 關(guān)于總RNA的提取

文庫構(gòu)建的質(zhì)量決定文庫應(yīng)用的價(jià)值，要想構(gòu)建好的文庫，最關(guān)鍵的步驟就是總RNA的提取［12］。在本次試驗(yàn)中分別采用Trizol試劑法和試劑盒（RNeasy Plus Mini Kit購(gòu)自Qiagen）兩種方法提取銅綠麗金龜雌蟲觸角總RNA。無論哪種方法在初始研磨階段都要進(jìn)行RNA酶的滅活，以免造成試驗(yàn)過程中總RNA的降解［18］。用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)兩種方法的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Trizol試劑法提取試蟲觸角總RNA 5S條帶明顯，且18S、28S有拖帶現(xiàn)象，降解嚴(yán)重；而采用試劑盒法提取總RNA幾乎看不到5S RNA，降解不明顯。核酸蛋白分析儀檢測(cè)總RNA濃度，結(jié)果表明，第二種方法獲得的總RNA濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于第一種方法，這表明采用第二種方法提取總RNA時(shí)需要準(zhǔn)備充足的原始材料。比對(duì)兩種方法的A260/A280值、A260/A230值，Trizol法提取的RNA兩個(gè)比值均小于1.5，這可能是由于組織裂解不夠充分，對(duì)雜質(zhì)的去除不夠徹底［19］；試劑盒法提取的總RNA兩個(gè)比值均大于2.0，表明提取的總RNA比較純，基本無蛋白和其他雜質(zhì)污染［19］。采用Qiagen公司的RNeasy Plus Mini Kit提取總RNA操作簡(jiǎn)單、快捷（只需1 h）且DNA污染少，雖然成本較高，但是比較適合少量RNA的提取［20］，因此本試驗(yàn)采用該法提取銅綠麗金龜觸角總RNA。此外，在選擇建庫起始材料時(shí)，要特別注意了解試蟲及其觸角的采集時(shí)間。本文建庫的目的在于獲取銅綠麗金龜觸角嗅覺相關(guān)蛋白，因此，在銅綠麗金龜成蟲尋找食物、配偶、產(chǎn)卵寄主盛期采集，且觸角的采集要迅捷，可保障所建文庫中具有較豐富的相關(guān)目的蛋白。

3.2 關(guān)于后續(xù)工作

自20世紀(jì)70年代中期首例cDNA克隆問世以來，構(gòu)建cDNA文庫已成為研究功能基因組學(xué)的基本手段之一［21］。構(gòu)建cDNA文庫可以保存瀕危珍稀生物資源，也可用于分離全長(zhǎng)基因進(jìn)行基因功能研究。根據(jù)一般文庫的構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)：未擴(kuò)增文庫滴度達(dá)1.0×106pfu/mL，試劑盒所提供的對(duì)照片段重組率達(dá)80%以上，所建文庫即為有效文庫。我們利用Qiagen公司的RNeasy Plus Mini Kit提取到了高質(zhì)量的總RNA，運(yùn)用SMART技術(shù)構(gòu)建了銅綠麗金龜雌蟲觸角cDNA文庫，經(jīng)檢測(cè)得原始文庫的滴度為6.74×106pfu/m L，文庫的重組率為98.98%，通過隨機(jī)PCR擴(kuò)增得知插入片段大小在500～2 000 bp范圍內(nèi)，且獲得了兩種不同的OBP基因編碼序列，這些數(shù)據(jù)表明已獲得高質(zhì)量的銅綠麗金龜雌蟲觸角cDNA文庫。本文僅進(jìn)行了銅綠麗金龜雌蟲cDNA文庫的構(gòu)建，由于雌雄兩性間常常存在嗅覺差異，大多數(shù)昆蟲氣味結(jié)合蛋白的表達(dá)與兩性存在不關(guān)聯(lián)現(xiàn)象［11-15］。因此，在后續(xù)工作中將以雄蟲相關(guān)試驗(yàn)作為對(duì)比補(bǔ)充，逐漸完善銅綠麗金龜觸角嗅覺相關(guān)蛋白的分析，為后期進(jìn)一步篩選、克隆以及表達(dá)更多嗅覺蛋白，從分子水平全面研究解析銅綠麗金龜嗅覺機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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Construction and quality analysis of a full-length cDNA library from antennae ofAnomala corpulentaMotschulsky

Zhao Ying1，2，Yin Jiao2，Li Kebin2，Cao Yazhong2，Wu Junxiang1
（1.Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northwest Loess Plateau，Ministry of
Agriculture，College of Plant Protection，Northwest A&F University，Yangling712100，China；
2.State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests，Institute of Plant
Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China）

In order to study the function of the olfactory associated proteins inAnomala corpulentaMotschulsky，a full-length cDNA library was constructed based on SMART technique.Total RNA was extracted from the female antennae ofA.corpulenta.The titer of primary library was6.74×106pfu/mL，and the recombinant rate was 98.98%.The amplified library showed a titer of 1.08×1010pfu/mL.Twenty-four monoclonal colonies had been picked randomly and detected by PCR.The results showed that the sizes of amplified fragments were 0.5－2.0 kb，with an average of 1.0 kb.By PCR and sequencing，this study obtained two full-length gene sequencesAcorOBP1 andAcorOBP2 that coding odorant binding proteins.These experiment data showed that a high-quality full-length cDNA library of the female antennae ofA.corpulentahad been constructed successfully，and also have screened and cloned the odorant binding protein gene sequences，which laying solid foundation for further research on the function of odorant binding proteins.

Anomala corpulenta； antennae； full-length cDNA library

Q 78.5

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.021

2014 01 26

2014 03 01

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201003025）

*通信作者 E-mail：junxw@nwsuaf.edu.cn