不同提取方法對蛹蟲草基質多糖的特性研究

王 雪，池玥蘭，華 春，汪振炯，吳雨龍，江海濤，周 峰，王仁雷

(1.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京 210046；2.南京曉莊學院生物化工與環境工程學院，江蘇南京 211171；3.江蘇第二師范學院生物系，江蘇南京 210013)

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不同提取方法對蛹蟲草基質多糖的特性研究

王 雪1，2，池玥蘭1，2，華 春2，汪振炯2，吳雨龍2，江海濤2，周 峰2，王仁雷3，*

(1.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京 210046；2.南京曉莊學院生物化工與環境工程學院，江蘇南京 211171；3.江蘇第二師范學院生物系，江蘇南京 210013)

以廢棄的蛹蟲草培養基基質為原料,利用水提法、酶解法、超聲波法、超聲波-酶法、微波法和微波-酶法來提取蛹蟲草基質多糖,研究不同提取方法下蛹蟲草基質多糖得率、多糖黏度及多糖抗氧化活性的區別來比較六種提取工藝的優缺點。結果表明:超聲波-酶法所得蛹蟲草基質多糖的得率最高,達30.27%,水提法最差,為10.69%。不同提取方法所得的多糖溶液黏度均隨多糖溶液濃度的增大而增大,在相同濃度下多糖溶液的表觀黏度大小依次為水提法>微波法>酶法>微波-酶法>超聲波法>超聲波-酶法。超聲波-酶法提取的蛹蟲草基質多糖體外抗氧化活性最好,而水提法的多糖抗氧化活性最差。

蛹蟲草,培養基,多糖,得率,黏度,抗氧化活性

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又名北冬蟲夏草,是著名的具有食藥用價值的食療菌種[1]。多糖作為蛹蟲草的主要功效成分之一,具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫、降血糖、抗炎等多種藥理作用[2]。蛹蟲草可以人工栽培,但栽培過程中有大量富含菌絲體的廢棄培養基被白白丟棄,造成寶貴資源浪費。研究表明,蟲草多糖是蛹蟲草菌絲體內中含量最多的藥理活性物質[3],因此從蛹蟲草廢棄培養基中提取蛹蟲草基質多糖,并研究該多糖的生理活性,可以實現廢物利用并提高蛹蟲草人工栽培的附加值[4]。

目前國內外有關蛹蟲草基質多糖的提取報道,多集中于水提法,亦有微波法、超聲波法、酶法等不同方法輔助提取[5-8],在研究中發現,不同的提取手段具有各自的優缺點,并且對多糖的活性影響各不相同。因此,本實驗采用了水提法、酶解法、超聲波法、超聲波-酶法、微波法以及微波-酶法等不同提取方法提取了蛹蟲草基質多糖,并探討了不同提取方法對蛹蟲草基質多糖的得率、黏度以及體外抗氧化活性的影響,同時較全面的比較各種方法的優缺點,旨在為進一步改進蛹蟲草基質多糖的提取工藝提供相應參考,也為進一步開發利用蛹蟲草基質多糖奠定相應基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

培養過蛹蟲草的大米培養基脫脂粉末 海安泓壽生物技術有限公司;纖維素酶(酶比活力50000U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司;無水乙醇(AR)、硫酸(AR)、苯酚(AR)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,AR)、七水合硫酸亞鐵(AR)、三氯甲烷(AR)、正丁醇(AR),水楊酸(AR)、雙氧水(AR)、鹽酸(AR)、鄰苯三酚(AR)、鐵氰化鉀(AR)、三氯乙酸(AR)、三氯化鐵(AR) 均為國藥集團化學試劑有限公司。

紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;Centrifuge 5810R冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;SHZ-111型循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;PHC-3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司;格蘭仕微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器有限公司;MixMax型渦旋振蕩器 合肥艾本森科學儀器有限公司;旋轉蒸發器RE-3000 上海亞榮生化儀器廠;全自動運動粘度測定儀YT-265Z 上海羽通儀器儀表廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛹蟲草基質粗多糖溶液的制備

1.2.1.1 水提法提取 稱取一定量樣品,料液比為1∶30(w/v)加入蒸餾水,在80℃下浸提2h,抽濾過濾得上清液,濾渣按上述方法重復提取一次,合并濾液,將濾液減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇,置于4℃冰箱過夜。次日,離心(4200r/min,10min)得多糖沉淀,用水復溶得蛹蟲草基質粗多糖溶液A。

1.2.1.2 超聲波法提取 稱取一定量樣品,料液比為1∶30(w/v)加入蒸餾水,超聲波提取(360W,50℃)50min,抽濾過濾得上清液,濾渣按上述方法重復提取一次,合并濾液,將濾液減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇,置于4℃冰箱過夜。次日,離心(4200r/min,10min)得多糖沉淀,用水復溶得蟲草基質粗多糖溶液B。

1.2.1.3 超聲波-酶法提取 稱取一定量樣品,料液比為1∶30(w/v)加入蒸餾水,調節pH至6.0,加纖維素酶酶解50min[9],之后超聲波提取(360W,50℃)50min,抽濾過濾得上清液,濾渣按上述方法重復提取一次,合并濾液,將濾液減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇,置于4℃冰箱過夜。次日,離心(4200r/min,10min)得多糖沉淀,用水復溶得蟲草基質粗多糖溶液C。

1.2.1.4 微波法提取 稱取一定量樣品,料液比為1∶30(w/v)加入蒸餾水,微波(480W)提取4min,抽濾過濾得上清液,濾渣按上述方法重復提取一次,合并濾液,將濾液減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇,置于4℃冰箱過夜。次日,離心(4200r/min,10min)得多糖沉淀,用水復溶得蛹蟲草基質粗多糖溶液D。

1.2.1.5 微波-酶法提取 稱取一定量樣品,料液比為1∶30(w/v)加入蒸餾水,調節pH至6.0,加纖維素酶酶解50min,之后微波提取4min,抽濾過濾得上清液,濾渣按上述方法重復提取一次,合并濾液,將濾液減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇,置于4℃冰箱過夜。次日,離心(4200r/min,10min)得多糖沉淀,用水復溶得蟲草基質粗多糖溶液E。

1.2.1.6 酶解法提取 稱取一定量樣品,料液比為1∶30(w/v)加入蒸餾水,調節pH至6.0,加纖維素酶酶解3h(60℃),之后100℃滅酶10min,冷卻,抽濾過濾得上清液,濾渣按上述方法重復提取一次,合并濾液,將濾液減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇,置于4℃冰箱過夜。次日,離心(4200r/min,10min)得多糖沉淀,用水復溶得蟲草基質粗多糖溶液F。

1.2.2 蛹蟲草基質精多糖的制備

1.2.2.1 脫色 向粗多糖液中加入1%(w/v)活性炭,75℃恒溫振蕩2.5h[10],再離心(4200r/min,10min)、棄沉淀。

1.2.2.2 脫蛋白 脫色后的多糖加Sevage液,萃取25min[11]。離心(3800r/min,10min),取最上層清液,重復上述操作至紫外掃描檢測在280nm處無明顯吸收,表明其中的蛋白類雜質已除盡。再向其中加4倍無水乙醇,放入冰箱靜置4h,取出離心(4200r/min,10min),棄去上清液,干燥沉淀即為精多糖。

1.2.3 蛹蟲草基質多糖含量測定及得率計算 采用苯酚-硫酸法[12]測定蛹蟲草多糖含量。多糖得率的計算方法如下:多糖得率以1g干品中提取出來的多糖總量的百分含量表示,計算公式如下:蟲草基質多糖得率(%)=多糖的質量/培養基基質樣品干物質的質量×100[7]

1.2.4 多糖黏度的測定 分別配制濃度為0.5、1.0mg/mL的多糖溶液,用LVDV-II+型Brookfield粘度儀(帶ULA附件)測試其黏度。

1.2.5 蛹蟲草基質多糖體外抗氧化性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力測定 配制0.2mmol/L DPPH自由基溶液,DPPH自由基與乙醇溶液混合后在517nm處有紫色基團特征吸收峰。將蛹蟲草多糖提取液按照一定濃度梯度(0.1、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL)稀釋,用蒸餾水調零。實驗分為樣品組(樣品+DPPH),對照組(樣品+無水乙醇)和空白組(DPPH+無水乙醇)。加入蛹蟲草多糖樣品和DPPH自由基溶液后,用渦旋振蕩器進行混勻,避光反應40min,在517nm處測其吸光值。按下式計算DPPH自由基清除率:DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100。

表1 不同提取方法下蛹蟲草基質多糖得率比較Table1 The extraction yield of Cordyceps militaris polysaccharides by different extraction methods

1.2.5.2 羥基自由基清除實驗 采用Fenton反應體系測定蛹蟲草基質多糖對·OH的抑制作用[13]。于10mL試管中依次加入2mL FeSO4溶液(6mmol/L)、2mL不同濃度的粗多糖(0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL)的樣品溶液、2mL H2O2(6mmol/L)溶液,充分搖勻,靜置10min。再加入6mmol/L的水楊酸溶液2mL,充分搖勻,靜置30min,在510nm處測定其吸光度值,計算清除率。

清除率計算公式:

式中:A0為空白對照液的吸光度;Aλ為加入樣品溶液的吸光度；Aλ0為H2O代替H2O2測得的待測液的本底吸收。

1.2.5.3 超氧陰離子自由基清除實驗 采用鄰苯三酚自氧化的方法測定。取4.5mL Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L),調pH至8.2,20℃水浴預熱20min,分別加入1mL不同(0.1、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL)濃度的蛹蟲草基質多糖溶液,再加入0.4mL鄰苯三酚溶液(25mmol/L),混勻,25℃水浴5min后加入1mL的鹽酸溶液(8mmol/L)終止反應,在波長229nm處測定吸光度,并計算清除率。

清除率計算公式:

清除率(%)=(A0-A)/A0×100

式中：A0為空白對照液的吸光度；A為加入多糖溶液的吸光度。

1.2.5.4 還原力測定 采用Oyaizu[14]的方法進行測定。取1mL不同(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mg/mL)濃度的蛹蟲草基質多糖溶液,然后分別加入5mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2mol/L,pH6.6)和5mL鐵氰化鉀溶液(1%),置于50℃水浴20min,然后加入2mL的三氯乙酸(10%),搖勻,離心,取上清液2mL加入2mL蒸餾水和0.4mL三氯化鐵溶液(0.1%),混合均勻,室溫下反應10min后在波長700nm處測定吸光值。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法下蛹蟲草基質多糖得率比較

由表1可知,在相同提取時間內,超聲波-酶法的得率最高,達到30.27%,約為水提法的2.8倍。單獨超聲波法及微波法的得率均高于水提法得率。該原因可以歸結為超聲波和微波有助于破壞蛹蟲草菌絲體的細胞壁,利于物料有效成分流出[7],因而多糖的得率較高。此外,添加纖維素酶之后,對多糖的得率均有一定提高。這可能因為細胞壁的主要組成成分是果膠和纖維素類物質,而纖維素酶能酶解細胞壁,在外力作用下,更有利于胞內多糖的溶出[15],因此超聲波-酶法和微波-酶法及單獨纖維素酶法的得率均高于相應對照。

2.2 多糖溶液黏度的比較

不同提取方法所得的多糖溶液黏度如圖1所示,由圖1可知,6種方法提取的多糖黏度均隨多糖溶液濃度的增大而增大。在多糖濃度相同時,多糖溶液的黏度從高到低依次為:水提法>微波法>酶法>微波-酶法>超聲波法>超聲波-酶法。表觀黏度取決于聚合物相對分子質量的大小、分子間的聚集和相互作用,據滕利榮[16]的研究表明,分子粘度與其分子量大小成正比關系,所以水提多糖分子量較大,可能因為水提法對多糖分子糖苷鍵破壞較少。而酶提法、超聲法及微波法所得多糖溶液黏度較小,表明其分子量較小,可能因為酶法、微波法和超聲法在破壞蛹蟲草基質細胞壁的同時使糖苷鍵斷裂,所以得到分子量較小的多糖。此外,經超聲波處理后多糖的分子量下降更加顯著,且超聲波結合酶法提取對多糖的降解作用更加顯著,原因可以歸結于超聲波處理對多糖分子的糖苷鍵破壞更加嚴重。

圖1 不同方法所得蛹蟲草基質多糖的黏度比較Fig.1 The viscosity of Cordyceps militaris polysaccharides by different extraction methods

2.3 不同提取方法下蛹蟲草基質多糖抗氧化性比較

2.3.1 DPPH自由基清除能力 從圖2可知,各種提取方法下得到的蛹蟲草基質多糖DPPH自由基清除能力均隨糖濃度的增大而升高。超聲波-酶法的DPPH自由基清除率最強,最高達到93.51%。六種方法提取的多糖的DPPH自由基清除能力從高到低依次為:超聲波-酶法>超聲波法>微波-酶法>酶法>微波法>水提法。這可能是因為酶液、超聲波、微波對蟲草大分子多糖有一定降解作用,使其溶解度增加,更多活性基團暴露,容易捕獲DPPH自由基。

圖2 不同提取方法下蛹蟲草基質多糖DPPH自由基清除能力比較Fig.2 DPPH radical scavenging activity of Cordyceps militaris polysaccharides by different extraction methods

2.3.2 羥基自由基清除能力 如圖3所示,超聲波-酶法對羥基自由基清除能力最強,水提法和微波法提取的蛹蟲草基質多糖的清除率較低且接近。同時,不同提取方法的蛹蟲草基質多糖對羥基自由基清除能力均隨多糖濃度的升高而增大。

圖3 不同提取方法下蛹蟲草基質多糖的羥基自由基清除率比較Fig.3 Hydroxyl radical scavenging activity of Cordyceps militaris polysaccharides by different extraction methods

2.3.3 超氧陰離子自由基清除能力 由圖4可知,水提法提取的蛹蟲草基質多糖清除超氧陰離子能力最低,而超聲波-酶法提取的蛹蟲草基質多糖清除超氧陰離子能力最高,在多糖濃度為2mg/mL時,清除率達到92.13%。多糖濃度在0.4mg/mL以后,各種方法提取的多糖對超氧陰離子的清除能力上升趨勢變大。

圖4 不同提取方法下蛹蟲草基質多糖清除超氧陰離子能力比較Fig.4 Comparative analysis of different extraction methods Cordyceps militaris polysaccharide matrix superoxide anion capacity

2.3.4 總還原力測定 據圖5得知,不同提取方法的蛹蟲草基質多糖的總還原力差別較大,由圖可得,蛹蟲草基質多糖的還原力隨著多糖濃度的增加而增強。水提法以及微波法的總還原能力最低,超聲波-酶提法所得多糖的總還原力最高,當多糖濃度為2.0mg/mL時,其總還原力高達0.306,是水提多糖的1.45倍,超聲法所得多糖的總還原力次之,為0.281。而水提法所得多糖的總還原力最低。

圖5 不同提取方法下蛹蟲草基質多糖還原能力比較Fig.5 The reducing power of Cordyceps militaris polysaccharides by different extraction methods

綜上所述,不同提取方法所得的蛹蟲草基質多糖抗氧化性均隨濃度的增加而增大,超聲波-酶法提取的多糖抗氧化活性最高,而微波-酶法提取時間最短,但抗氧化性一般。有研究表明超聲波-酶法提取的小分子量多糖較多,從而提高多糖的抗氧化性。水提法多糖抗氧化活性均為最低。

3 結論

本實驗采用水提法、酶解法、超聲波法、超聲波-酶法、微波法和微波-酶法六種提取方法提取蛹蟲草基質多糖,其中超聲波-酶法所得蛹蟲草基質多糖的得率最高、黏度最低、抗氧化活性也最強,且不同的提取方法提取的多糖活性不同。通過對六種蛹蟲草基質多糖提取方法的比較,可為以后的蛹蟲草基質多糖的提取利用提供一定的依據。

[1]凌建亞,孫迎節,呂鵬,等. 蟲草屬真菌中蟲草素的超聲波提取及其毛細管電泳測定[J].菌物系統,2002,21(3):394-399.

[2]胡征,李華屏,葉茂青.冬蟲夏草菌藥理功能研究進[J]. 氨基酸和生物資源,2003,25(4):20-22.

[3]鄭貴朝,喻孟君,張善信,等.固體培養基上蛹蟲草菌絲體生長情況的觀察[J].中國食用菌,2008,27(6):46-48.

[4]倪賀,李海航,黃文芳,等.北蟲草及其活性成分的研究與開發[J].科技導報,2007,25(15):75-79.

[5]羅登林,丘泰球,盧群.超聲波技術及應用(III)—超聲波在分離技術方面的應用[J].日用化學工業,2006,2(1):46-49.

[6]翁梁,溫魯,楊芳,等.不同提取方法對蛹蟲草抗氧化性的影響[J]. 食品科技,2008,33(11):180-182.

[7]汪振炯,王仁雷,吳雨龍,等.微波協同酶法提取蛹蟲草基質多糖工藝的優化研究[J]. 食品工業科技，2014,35(11):188-192.

[8]Li Hong-wei,Zhou Guo-yan,Guo Hui-qing,et al.Comparation of the extraction methods of Lentinus edodes polysaccharides[J].Food Science,2008,29(11):173-174.

[9]劉紅錦,蔣寧,李建軍,等.蛹蟲草多糖提取及純化工藝研究[J].江西農業學報,2007,19(12):80-82.

[10]劉光銓,江南生.果脯生產中廢糖液的澄清與脫色研究[J].云南工業大學學報,1995(4):28-30.

[11]劉玲,安家彥,金鳳燮.蛹蟲草多糖除雜蛋白的方法[J].大連輕工業學院學報,2002,3(1):33-37.

[12]魯曉巖.硫酸-苯酚法測定北冬蟲夏草多糖含量[J].食品工業科技,2002,23(4):69-70.

[13]Hassan H M. Detemination of microbial damage caused by oxygenfree radicals,and the protective rule of superoxide disemtase//PACKERL.Methods in enzumology[M]. New York:Academic Press,1984,105:404-412.

[14]Oyaizu M. Studies on products of browning reactions:Antioxidative activities products of browning reaction prepared from glucosamine[J]. Japanese Journal of Nutrition,1986,44:307-315.

[15]趙晨淏,劉鈞發,馮夢瑩,等.不同提取方法對龍眼多糖性質的影響[J].現代食品科技,2012,28(10)：1298-1301.

[16]滕利榮,洪水聲,孟慶繁,等.普魯蘭多糖的粘度性質研究[J].食品科學,2003,24(10):32-35.

Effect of different extraction methods on the feature of polysaccharide inCordycepsMilitaris

WANG Xue1,2,CHI Yue-lan1,2,HUA Chun2,WANG Zhen-jiong2,WU Yu-long2,JIANG Hai-tao2,ZHOU Feng2,WANG Ren-lei3,*

(1.College of Life Sciences,Nanjing Normal University,Nanjing 210046,China;2.School of Biochemical and Environmental Engineering,Nanjing Xiaozhuang College,Nanjing 211171,China;3.biology Department,Jiangsu Second Normal University,Nanjing 210013,China)

Six different extraction methods,including water extraction,enzymatic extraction,ultrasonic method,ultrasonic-enzymatic method,microwave method and microwave-enzyme method,were used to extractCordycepspolysaccharide fromCordycepsmilitarisculture medium. The extraction yield,viscosity and the impact of antioxidation were evaluated to compare the advantage and disadvantage of different extraction methods. The results showed that polysaccharide prepared by ultrasonic-enzymatic extraction showed the highest extraction yield 30.27%,while that of water extraction showed the lowest yield 10.69% at the same time. Polysaccharide viscosity with the increase of polysaccharide solution concentration by different extraction methods,the apparent viscosity at the same concentration was:water extraction>microwave extraction>enzyme extraction>microwave-enzymatic extraction>ultrasonic extraction>ultrasonic-enzymatic extraction. The polysaccharide prepared by ultrasonic-enzymatic extraction exhibited the strongest antioxidant activity,while that of water extraction showed the lowest antioxidant activity.

Cordycepsmilitaris;medium;polysaccharides;extraction rate;viscosity;antioxidant activity

2014-08-06

王雪(1988-)，女，研究生，研究方向：生物資源開發與利用。

*通訊作者:王仁雷(1963-)，男，博士，教授，研究方向：功能性生物大分子、植物生物化學。

國家自然科學基金項目(21376112)；國家高技術研究發展計劃項目(2012AA021701)；江蘇省自然科學基金(BK20131344)；2013年江蘇省人大學生實踐創新訓練計劃項目(201311460012Z)；南京曉莊學院校科研項目(2012NXY08)。

TS201.2

A

:1002-0306(2015)09-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.001