棗花蜜和蕎麥蜜中葡萄糖氧化酶的活性及熱穩定性研究

王 萌,杜 冰,曹 煒,2,*

(1.西北大學 化工學院,陜西西安 710069;2.陜西省蜂產品工程技術研究中心,陜西西安 710065)

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棗花蜜和蕎麥蜜中葡萄糖氧化酶的活性及熱穩定性研究

王 萌1,杜 冰1,曹 煒1,2,*

(1.西北大學 化工學院,陜西西安 710069;2.陜西省蜂產品工程技術研究中心,陜西西安 710065)

分別測定了不同地理源的棗花蜜和蕎麥蜜中葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)的活性。在測定的棗花蜜樣品中陜西佳縣棗花蜜GOD活性最高,為(0.161±0.002)U/g,山西呂梁棗花蜜GOD活性最低,為(0.007±0.001)U/g；蕎麥蜜中四川西昌蕎麥蜜GOD活性最高,為(0.112±0.001)U/g,山西晉北蕎麥蜜GOD活性最低,為(0.007±0.001)U/g。結果表明,蜂蜜植物源不同,GOD活性不同；植物源相同時,地理源不同,蜂蜜中GOD活性差異也較大。對GOD的熱穩定性研究表明,棗花蜜中的GOD在70℃加熱90min活性完全損失,蕎麥蜜GOD活性仍有部分殘存,表明四川西昌蕎麥蜜中的GOD熱穩定性較陜西佳縣棗花蜜高。

蜂蜜,葡萄糖氧化酶,熱穩定性

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,與自身分泌物結合后經充分釀造而成的天然甜物質[1]。蜂蜜中除了含有豐富的碳水化合物外,還含有維生素、酚酸、黃酮類物質、游離氨基酸、有機酸及酶類等多種營養素和生物活性成分[2]。這些物質與蜂蜜多種生物活性相關,如抑菌、抗氧化及抗炎等[3]。其中,蜂蜜的抑菌活性,與其高滲透壓、所含葡萄糖氧化酶(GOD)產生的過氧化氫(H2O2)等相關[4-5]。

目前測定GOD活性的方法有多種,如滴定分析法和傅立葉紅外變換色譜法等[12-16]。辣根過氧化物酶-鄰聯茴香胺法一直廣泛應用于食品中GOD活性測定,但由于鄰聯茴香胺具有一定致癌性,因而需要一種較為安全的方法替代該法。本文采用GOD催化葡萄糖生成的H2O2在辣根過氧化物酶的催化下與4-氨基安替比林、苯酚及溶液中的二氧化碳反應生成紅色醌亞胺來測定蜂蜜中的GOD活性,該法具有簡便、靈敏度高、重現性好等優點[17-18]。此外,本文對棗花蜜和蕎麥蜜中GOD的熱穩定性進行了初步研究。本文研究結果可以為揭示蜂蜜的抑菌活性機制和質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源信息

蜂蜜樣品 由蜂農或蜂場提供,主要花粉孢子比率大于50%確定為單花種蜂蜜。蜂蜜樣品采集地點與采集時間詳見表1。

1.2 試劑與儀器

辣根過氧化物酶 南京都萊生物技術有限公司,純度:生化級；4-氨基安替比林,30% H2O2,Na2HPO4·12H2O,NaH2PO4·2H2O 均為國產分析純試劑。

751-GD紫外可見分光光度計 上海分析儀器廠。

表1 蜂蜜樣品信息Table1 Information of honey samples

1.3 測定方法

1.3.1 溶液配制 稱取3.5mg辣根過氧化物酶和3.5mg 4-氨基安替比林溶于20mL磷酸緩沖液(0.02mol/L,pH4.7)中,再加入1mL濃度為3%的苯酚溶液即為溶液A,混勻置于冰箱中備用；將葡萄糖配制成6.5%的溶液B；用磷酸緩沖液(0.02mol/L,pH4.7)將蜂蜜樣品稀釋至0.2g/mL,置于冰箱中備用。

1.3.2 過氧化氫含量標準曲線的測定 向9支棕色試管中分別加入2.50、2.45、2.40、2.35、2.30、2.25、2.20、2.15、2.10mL緩沖液和1.5mL溶液A,混勻,依次加入0、50、100、150、200、250、300、350、400μL 2mmol/L的H2O2溶液。混合均勻,35℃下反應5min,反應終止后在500nm波長下測定吸光度。以吸光度為縱坐標,H2O2含量為橫坐標作圖,即為標準曲線。

1.3.3 蜂蜜樣品中的GOD活性測定 分別取1.5mL溶液A,1.5mL溶液B,緩沖液200μL于試管中。向試管中加入800μL配制好的蜂蜜樣品溶液,混勻后將樣液置于35℃環境中,測定其在500nm波長下15min內吸光度的變化。以每分鐘催化1μmol葡萄糖生成H2O2和葡萄糖酸所需的酶量為1個GOD酶活力單位,用U表示。將相同的蜂蜜樣品溶液在沸水中加熱10min,保證酶失活,作為空白對照。

1.3.4 熱穩定性測定 將一定量的棗花蜜和蕎麥蜜分別在50、60、70℃下加熱30、60、90、120、150、180min。取出后,立即用冰水冷卻,采用上述測定樣品中GOD活性的方法進行熱穩定性實驗。

1.4 實驗數據統計分析

每個實驗均重復三次,實驗數據采用origin 8.0軟件處理,并用SPSS 17.0軟件對數據進行差異顯著性分析(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 過氧化氫含量標準曲線

對反應液吸光值和生成的H2O2的量進行線性回歸,求得回歸方程和相關系數分別為:y=0.8727x+0.0059,R2=0.9976。如圖1所示,結果表明,H2O2濃度在測量范圍內與吸光度具有良好的線性關系。

圖1 H2O2含量標準曲線Fig.1 Standard curve of H2O2

2.2 蜂蜜樣品中GOD活性

按照上述實驗方法,本文測定了不同產地的棗花蜜和蕎麥蜜中GOD活性,結果如表2所示。

由表2可知,棗花蜜和蕎麥蜜的GOD活性存在顯著差異,棗花蜜樣品GOD的最高活性為(0.161±0.002)U/g,平均值為(0.089±0.051)U/g；蕎麥蜜GOD最高活性僅為(0.112±0.002)U/g,平均值為(0.044±0.030)U/g。此實驗結果與金銀花蜜、野菊蜜及野壩子蜜中GOD活性(經單位換算分別約0.056、0.029、0.054U/g)相當[19-21]。該結果表明,蜂蜜植物源不同,其GOD活性不同。此外,植物源相同而產地不同時,蜂蜜的GOD活性亦有較大差異,如陜西佳縣棗花蜜GOD活性為(0.161±0.002)U/g,而同一年采集的河南吳堡棗花蜜GOD活性為(0.129±0.002)U/g,兩者之間存在顯著性差異,這一現象在蕎麥蜜中亦存在,這可能與蜂蜜采集時間、采集氣候、采集蜂的種類等多種因素相關。

表2 棗花蜜和蕎麥蜜樣品中葡萄糖氧化酶的活性Table2 Results of glucose oxidase activities in honey samples

注:字母不同表示差異性顯著,字母相同表示差異性不顯著(p<0.05)。

除了棗花蜜和蕎麥蜜兩種蜂蜜外,本文對油菜蜜、洋槐蜜、龍眼蜜、荊條蜜、枸杞蜜等一些蜂蜜中的GOD活性也進行了測定,但這些樣品中GOD活性很低(數據未列出),部分樣品的GOD活性幾乎為零,可能與蜂蜜的種類和釀制時間有關,其原因有待進一步研究。

2.3 棗花蜜和蕎麥蜜中GOD的熱穩定性

蜂蜜加工一般要經過二次加熱,解晶和真空濃縮等處理,蜂蜜經過熱加工后GOD活性可能部分失活,本研究考察了陜西佳縣棗花蜜和四川西昌蕎麥蜜的熱穩定性,結果如圖2和圖3所示。

圖2 溫度對棗花蜜GOD活性的影響Fig.2 Effect of temperature on GOD activity in jujube honey

圖3 溫度對蕎麥蜜GOD活性的影響Fig.3 Effect of temperature on GOD activity in buckwheat honey

由圖2可知,棗花蜜GOD活性隨加熱溫度的升高而降低,70℃加熱10min,GOD活性降低67%,加熱90min,GOD完全失活,60℃加熱30min,GOD活性損失22%,50℃加熱30min,GOD活性降低11%。可見,當溫度達到70℃時,GOD活性顯著降低。

由圖3可知,50℃加熱30min,蕎麥蜜中GOD活性損失了12%,60℃加熱30min,GOD 活性損失了54%,但隨加熱時間的延長GOD活性基本不變,70℃加熱30min,GOD 活性損失了88%,此后隨加熱時間的延長,GOD活性趨于平穩。

本文研究表明,當溫度達到70℃時,棗花蜜和蕎麥蜜中GOD活性均顯著下降。與蕎麥蜜相比,棗花蜜中GOD活性較高但熱穩定性較差,70℃加熱30min酶活性損失91%,加熱90min后GOD完全失活,蕎麥蜜中GOD仍有活性,這可能與蕎麥蜜的復雜組成有關,其原因有待進一步探究。本實驗結果與曾哲靈等的研究結果相近,曾哲靈等研究發現,當加熱溫度低于55℃時,野菊蜜中GOD活性在加熱過程中變化不明顯；當加熱溫度高于60℃時,在加熱過程GOD活性損失較大[18]。

3 結論

本實驗通過H2O2與4-氨基安替比林、苯酚、CO2等反應生成紅色醌亞胺,間接測定了蜂蜜GOD活性。結果發現,蜂蜜中GOD活性在植物源和地理源上存在顯著差異(p<0.05),這可能與蜂蜜的采集時間、成熟過程、地理因素等多種因素相關。棗花蜜在70℃時加熱90min后GOD完全失活,但是蕎麥蜜仍有一定活性,表明四川西昌蕎麥蜜的GOD熱穩定性高于陜西佳縣棗花蜜。

[1]馮繼讓. 國家《蜂蜜》標準解讀[J]. 蜜蜂雜志,2011,1:8-11.

[2]Escuredo O,Silva L R,Valent?o P,et al. Assessing Rubus honey value:Pollen and phenolic compounds content and antibacterial capacity[J]. Food Chemistry,2012,130(3):671-678.

[3]Liu J R,Ye Y L,Lin T Y,et al. Effect of floral sources on the antioxidant,antimicrobial,and anti-inflammatory activities of honeys in Taiwan[J]. Food Chemistry,2013,139(1-4):938-943.

[4]Snow M J,Harris M M. On the nature of non-peroxide antibacterial activity in New Zealand manuka honey[J]. Food Chemistry,2004,84(1):145-147.

[5]Brudzynski K. Effect of hydrogen peroxide on antibacterial activities of Canadian honeys[J]. Canadian Journal of Microbiology,2006,52(12):1228-1237.

[6]White J W J,Subers M H,Schepartz A I. The identification of inhibine,the antibacterial factor in honey,as hydrogen peroxide and its origin in a honey glucose-oxidase system. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Specialized Section on Enzymological Subjects,1963,73:57-70.

[7]Sandip B B,Mahesh V B,Rekha S S,Laxmi A. Glucose oxidase-An overview[J]. Biotechnology Advances,2009,27:489-501.

[8]Bang L M,Buntting C,Molan P. The effect of dilution on the rate of hydrogen peroxide production in honey and its implications for wound healing[J]. Journal of Alternative and Complementary Medicine,2003,9:267-273.

[9]Tur E,Bolton L,Constantine B E. Topical hydrogen peroxide treatment of ischemic ulcers in the guinea pig:blood recruitment in multiple skin sites[J]. Journal of the American Academy of Dermatology,1995,33:217-221.

[10]Kwakman P H S,Zaat S A J. Antibacterial components of honey[J]. IUBMB Life,2012,64(1):48-55.

[11]Kwakman P H S. Two major medicinal honeys have different mechanisms of bactericidal activity[J]. PLOS One,2011,6:e17709.

[12]Tongbu L,Peng X,Yang H,et al. The production of glucose oxidase using the waste myceliums of Aspergillus niger and the effects of metal ions on the activity of glucose oxidase[J]. Enzyme and Microbial Technology,1996,19:339-342.

[13]Witt S,Singh M,Kalisz H. Structural and kinetic properties of nonglycosylated recombinant Penicillium amagasakiense glucose oxidase expressed inEscherichiacoli[J]. Applied and Environmental Microbiology,1998,64(4):1405-1411.

[14]Gutmann I,Wahlefeld A W,Bergmeyer H U. Methods of enzymatic analysis[J]. Academic Press,1974,3:457-458.

[15]Petruccioli M,Federici F,Bucke C,Keshavarz T. Enhancement of glucose oxidase production by Penicillium variabile P16[J]. Enzyme and Microbial Technology,1999,24:397-401.

[16]Karmali K,Karmali A,Teixeira A,Marcelo M. Assay for glucose oxidase from Aspergillus niger and Penicillium amagasakiense by Fourier transform infrared spectroscopy[J]. Analytical Biochemistry,2004,333:320-327.

[17]翟彤宇,單金緩. 葡萄糖氧化酶催化反應動力學特征及其抑制劑[J]. 河北省科學院學報,1998,18(2):203-205.

[18]劉文涵,魯汝慶.催化動力學光度法測定葡萄糖氧化酶活性研究[J]. 分析化學,1993,21(1):66-69.

[19]曾哲靈,薛艷輝,高蔭榆. 金銀花蜜中生物酶的熱穩定性[J]. 南昌大學學報,2006,30(1):29-31.

[20]曾哲靈,靈胡虹,熊濤,等. 野菊蜜中生物酶的耐熱性能研究[J]. 食品與發酵工業,2005,31(11):43-45.

[21]范路軍,和紹禹,張永云,等. 不同貯存條件和時間對野壩子蜜中葡萄糖氧化酶活性的影響[J]. 蜜蜂雜志,2013,33(5):12-14.

Research of activity and thermal stability of GOD in jujube and buckwheat honeys

WANG Meng1,DU Bing1,CAO Wei1,2，*

(1.Department of Food Science and Technology,College of Chemical Engineering,Northwest University,Xi’an 710069,China;2.Bee Product Research Center of Shaanxi Province,Xi’an 710065,China)

The activities of glucose oxidase in jujube and buckwheat honey of different geographical sources were determined. Jujube honey from Jiaxian,Shanxi Province and buckwheat honey from Xichang,Sichuan Province had the highest glucose oxidase activity with the value of(0.161±0.002)U/g and(0.112±0.001)U/g,respectively. The activity of GOD in Lvliang,Shanxi jujube honey samples was only(0.007±0.001)U/g,and the lowest activity appeared in buckwheat honey from Jinbei,Shanxi Province with the same value. The results showed that the GOD activity varied significantly between different botanical and geographical sources of Chinese unifloral honey. Furthermore,thermal stability of GOD in these two honey samples was detected. The result showed that with increasing of temperature,the activity of GOD in jujube was reduced and there was no activity when the temperature up to 70℃ with 90min. Under the same conditions,the activity of GOD still can be determined in buckwheat honey. This research indicated that the thermal stability of buckwheat honey was higher than jujubehoney.

honey；glucose oxidase activity；thermal stability

2014-07-22

王萌(1990-)，女，碩士，研究方向：蜂蜜中的活性成分及其研究。

*通訊作者:曹煒(1969-),男，博士，教授，研究方向：食品中活性成分及其評價。

國家自然科學基金(31272510)；西安市農業技術研發項目(NC1405(1))。

TS201.2

A

:1002-0306(2015)09-0083-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.009