銀杏愈傷組織黃酮提取條件的正交實驗優化

梁文惠,黃 翔,林麗春,夏年益,張 珣,彭春林,丘 添,施曉宇,鄧祥宜

(華中農業大學楚天學院食品與生物科技學院,湖北武漢 430205)

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銀杏愈傷組織黃酮提取條件的正交實驗優化

梁文惠,黃 翔,林麗春,夏年益,張 珣,彭春林,丘 添,施曉宇,鄧祥宜*

(華中農業大學楚天學院食品與生物科技學院,湖北武漢 430205)

以銀杏愈傷組織為材料,對銀杏黃酮的提取條件進行優化。通過單因素實驗研究乙醇濃度、液料比、微波功率、微波時間、水浴溫度、水浴時間等對黃酮得率的影響,并進行了正交實驗優化。正交實驗的結果表明:以40%乙醇為提取溶劑,液料比25∶1,在中火檔(528W)微波60s,不進行水浴處理,黃酮得率達到20.92mg/g。

銀杏愈傷組織,黃酮,提取條件優化,正交實驗,微波處理

銀杏黃酮具有抗衰老、提高免疫機能、防治心血管病的作用[1-2]。國際市場上的天然藥物中銀杏黃酮制劑是用量最大的種類之一,銀杏保健食品也很受人們青睞。隨著我國人口老齡化的快速發展,心血管疾病發病率的增加,銀杏黃酮相關的藥品和保健品產業將會持續發展。目前銀杏黃酮主要從葉片中提取,近年來,銀杏葉中黃酮提取方法的研究也較多[3-7]。但大面積栽培銀杏占用大量耕地,給農業生產造成一定影響;同時葉片中的藥用成分含量比較低,提取工藝復雜,易受季節限制[8]。利用組織培養大規模生產黃酮、銀杏內酯等藥用成分,不但可以節省土地資源,而且可以提高生產效益。人們對銀杏愈傷組織的誘導、繼代進行了研究[8-9],但對愈傷組織中黃酮提取條件的研究較少。本文通過單因素實驗和正交實驗優化了微波法提取銀杏愈傷組織中黃酮的相關條件,以期為組織培養法生產銀杏黃酮的研究和生產實踐作鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏愈傷組織 華中農業大學楚天學院實驗教學中心;蘆丁標準品 國藥集團化學試劑有限公司;其它試劑均為分析純。

電熱恒溫鼓風干燥箱DH6-914385-Ⅲ 上海新苗醫療器械制造有限公司;電子天平FA2104B 上海越平科學儀器有限公司;高速離心機TDL-5-A 上海安亭科學儀器廠;微波爐P80D23N1P-B5(B0) 佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司;數顯恒溫水浴鍋HH-6 國華電器有限公司;分光光度計722 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料培養及處理 愈傷組織培養以MS培養基外加0.5mg/L NAA,0.25mg/L 6-BA、1%瓊脂和3%的蔗糖為繼代培養基,培養溫度25±1℃,避光培養75d后收獲。120℃滅酶10min,60℃烘干至恒重,研磨后過60目篩得到銀杏愈傷組織粉末,干燥器中保存備用。

1.2.2 黃酮提取工藝流程 銀杏愈傷組織粉末→加入乙醇水溶液→搖勻后微波處理→(水浴浸提)→4000r/min離心15min→取上清液測定黃酮含量,計算得率。

1.2.3 黃酮測定方法 黃酮含量測定方法采用Al(NO3)3顯色法,參照文獻[4,10],略有改動,具體操作如下:

蘆丁標準曲線的繪制:準確稱取25mg蘆丁標準品,用80%(v/v)乙醇溶液溶解,定容到250mL,得0.1mg/mL的蘆丁標準液。取6支(編號0、1、2、3、4、5)25 mL的比色管,依次加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL蘆丁標準液,再分別加80%(v/v)的乙醇溶液至5mL,搖勻;各加入5%的NaNO2溶液0.3mL,搖勻,靜置5min;各加入10%的Al(NO3)3溶液0.3mL,搖勻,靜置6min;再各加入1mol/L的NaOH溶液4mL,定容至10mL,充分搖勻,以0號比色管為參比,在510nm下測定1-5號比色管的吸光度,以蘆丁含量(mg)為橫坐標,以吸光度(A510)為縱坐標作蘆丁標準曲線。

提取液中黃酮含量測定:取適量體積(V1)的提取液加入25mL的比色管中,按上述標準曲線中的方法進行定容、顯色、測定吸光值,參照標準曲線計算黃酮含量(x1),進而計算黃酮得率:

V1:分光光度法測定黃酮含量所用提取液體積;x1:所用提取液中的黃酮含量(參照標準曲線計算);V總:提取液總體積。

1.2.4 單因素實驗方法

1.2.4.1 乙醇濃度的優化 稱取7份0.2g干燥銀杏愈傷組織粉末置于7個10mL離心管中,然后向每支離心管中分別加入30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%(v/v)的乙醇水溶液5mL,搖勻,將離心管(每次4支,不足時用裝等體積水的離心管補齊)放入微波爐中,解凍檔微波60s(每5s取出水浴冷卻1次,搖勻后繼續進行微波)。再放入80℃水浴鍋中水浴2h(每15min搖勻1次)。水浴結束后,4000r/min離心15min,吸取上清液按照1.2.3中方法測定黃酮含量,計算黃酮得率。每個梯度做兩組平行實驗,結果以平均值±標準差表示。繪圖分析乙醇濃度對黃酮得率的影響。

1.2.4.2 液料比的優化 保持提取劑(40%乙醇)體積為5mL不變,改變粉末重量,研究不同液料比(10∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、100∶1)對黃酮得率的影響。其他條件參數參見1.2.4.1。

1.2.4.3 微波功率的優化 研究不同微波功率(低火、解凍、中火、中高火、高火檔,對應的功率值分別為136、296、528、680、800W)對黃酮得率的影響。提取劑為40%乙醇,液料比為25∶1,其他條件參數參見1.2.4.1。

1.2.4.4 微波時間的優化 研究不同微波時間(0、10、20、40、60、80、100、120、140s)對黃酮得率的影響。提取劑為40%乙醇,液料比為25∶1,微波功率為解凍檔(296W),其他條件參數參見1.2.4.1。

1.2.4.5 水浴溫度的優化 研究不同水浴溫度(50、60、70、80、90℃)對黃酮得率的影響。提取劑為40%乙醇,液料比為25∶1,微波功率為解凍檔(296W),微波時間為60s,其他條件參數參見1.2.4.1。

1.2.4.6 水浴時間的優化 研究不同水浴時間(0、1、2、3、4、5h)對黃酮得率的影響。提取劑為40%乙醇,液料比為25∶1,微波功率為解凍檔(296W),微波時間為60s,水浴溫度80℃,其他條件參數參見1.2.4.1。

1.2.4.7 提取次數的選擇 研究提取次數(1、2、3次)對黃酮得率的影響。提取劑為40%乙醇,液料比為25∶1,微波功率為解凍檔(296W),微波時間為60s,水浴溫度80℃,水浴時間2h,其他條件參數參見1.2.4.1。

1.2.5 正交實驗方法 在單因素實驗基礎上,按照正交表L9(33)安排實驗(見表1),通過極差分析找出最優組合,3因素外的其它條件為單因素實驗最優條件。并在正交實驗獲得的最優條件下進行4次平行實驗,以驗證結果的可靠性。

表1 正交實驗因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以蘆丁含量(mg)為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制蘆丁標準曲線,見圖1。所得回歸方程為y=1.233x-0.0029,R2=0.9995,方程線性關系很好。

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The rutin calibration curve

2.2 單因素實驗結果及分析

2.2.1 不同乙醇濃度對黃酮得率的影響 不同乙醇濃度對黃酮得率影響的實驗結果(圖2)表明:乙醇濃度為30%時,黃酮的得率為18.89mg/g,隨著乙醇濃度的升高,黃酮得率逐漸升高,在乙醇濃度為40%時得率達到最大,為21.01mg/g,當乙醇濃度超過40%時,黃酮得率反而隨著乙醇濃度的升高而降低。這可能是因為在銀杏愈傷組織中黃酮以黃酮糖苷的形式存在,有一定的親水性,乙醇濃度過大反而不利于其溶解。因此,40%乙醇為本實驗的最佳濃度。

圖2 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extraction rate

2.2.2 不同液料比對黃酮得率的影響 不同液料比對黃酮得率影響的實驗結果(圖3)表明:液料比為10∶1時,黃酮得率為7.97mg/g;隨著液料比的增大,黃酮得率迅速上升,當液料比為25∶1時,黃酮得率為21.28mg/g;之后,黃酮得率仍隨著液料比的增大而上升,但上升趨勢逐漸減小。由此可知,液料比的提高有利于總黃酮的提取,這可能是因為隨著溶劑的增加,黃酮擴散出來的傳質動力也加大。工業生產中,由于液料比的增大而使得容器利用效率降低和后續濃縮困難。從節省提取劑、提高容器利用效率以及便于后續濃縮、純化處理等角度考慮,本實驗選擇液料比25∶1為最佳液料比。

圖3 液料比對黃酮得率的影響Fig.3 The effect of liquid-powder ratio on the extraction rate

2.2.3 不同微波功率對黃酮得率的影響 不同微波功率對黃酮得率影響的實驗結果(圖4)表明:低火檔(136W)時黃酮得率較低,隨著火力增強黃酮得率有所增加,在中高火檔(680W)時達到最高,為22.15mg/g,而高火(800W)時黃酮得率出現下降。這可能是由于過高的微波功率對黃酮類物質有破壞作用,導致得率下降。因此,選擇中高火檔(680W)為本實驗最佳提取功率。

圖4 微波功率對黃酮得率的影響Fig.4 The effect of microwave power on the extraction rate

2.2.4 不同微波時間對黃酮得率的影響 不同微波時間對黃酮得率影響的實驗結果(圖5)表明:微波時間為0s時,黃酮得率為17.19mg/g,隨著時間的延長,黃酮得率迅速增加,當微波時間為40s時,黃酮得率達20.86mg/g,超過40s后,黃酮得率隨著處理時間的延長呈現震蕩并緩慢上升的趨勢。因此,可認為最佳微波時間為40s。

圖5 微波時間對黃酮得率的影響Fig.5 The effect of microwave processing time on the extraction rate

2.2.5 不同水浴溫度對黃酮得率的影響 不同水浴溫度對黃酮得率影響的實驗結果(圖6)表明:水浴溫度為50℃時,黃酮得率為21.28mg/g,隨著水浴溫度的升高,黃酮得率在整體上呈現先上升后下降趨勢,在70℃時黃酮得率達到最大,為22.09mg/g。70℃之后得率隨溫度升高有下降趨勢。這可能是因為溫度升高有利于黃酮類物質溶出,但溫度過高又可能對黃酮類物質有一定破壞作用。因此選用70℃為最佳水浴溫度。

圖6 水浴溫度對黃酮得率的影響Fig.6 The effect of water bath temperature on the extraction rate

2.2.6 不同水浴時間對黃酮得率的影響 不同水浴時間對黃酮得率影響的實驗結果(圖7)表明:當水浴時間為0h時,黃酮得率為19.58mg/g;水浴2h時,黃酮得率出現峰值,為20.66mg/g;2h以后,得率則隨著時間的延長呈現下降趨勢。這是因為:在2h內黃酮化合物不斷溶出,從而浸提時間越長黃酮得率越高;2h后,黃酮化合物溶出不再明顯,而且由于長時間處于高溫狀態,可能導致黃酮化合物結構發生變化而失活,從而隨著浸提時間的延長,黃酮得率呈現下降趨勢。

水浴2h時的黃酮得率最大,為20.66mg/g,但與水浴0h的黃酮得率19.58mg/g相比,僅提高了1.08mg/g(約5.5%),從簡化提取工序、降低能耗等角度出發,水浴0h(即不進行水浴處理)為最佳選擇。

圖7 水浴時間對黃酮得率的影響Fig.7 The effect of water bath processing time on the extraction rate

2.2.7 不同提取次數對黃酮得率的影響 不同提取次數對黃酮得率影響的實驗結果(圖8)表明:第1次的黃酮得率達到了21.17mg/g,占前3次總得率的77.95%;第2次的黃酮得率為4.40 mg/g,占前3次總得率的16.20%;第3次的黃酮得率為1.59mg/g,只占前3次總得率的5.85%。提取次數增多可以提高累計得率,但增加提取次數會成倍地增加乙醇用量、操作時間等成本,而黃酮產量增加卻很少。因此生產中選擇1次提取為最優。如果是實驗中為了考察愈傷組織中的真實含量,可提取兩次,此時累計得率占總得率的94.15%,基本可以代替材料中的總黃酮含量。

圖8 提取次數對黃酮得率的影響Fig.8 The effect of extraction times on the extraction rate

2.3 正交實驗結果及分析

根據單因素實驗結果,從提取工藝中去掉水浴處理過程,選取微波功率、乙醇濃度、微波時間進行3因素3水平的正交實驗設計,其余條件為單因素實驗的最優條件。正交實驗結果(表2)表明:各因素對黃酮得率影響的大小次序依次為:乙醇濃度>微波時間>微波功率。黃酮得率最高的優水平組合是A1B2C3,即微波功率為中火檔(528W),提取溶劑為40%乙醇,微波時間為60s,其余條件為單因素最優條件。

驗證性實驗結果(表3)表明:在正交實驗最優條件下,黃酮得率達到20.92±0.28mg/g,考慮到實驗誤差,高于正交實驗中其他梯度,因此正交實驗結果可信。

表2 L9(33)正交實驗結果Table2 The result of the L9(33)orthogonal experiment

表3 驗證性實驗結果Table3 The result of verification experiment

3 結論與討論

本研究通過單因素實驗和正交實驗,得到了銀杏愈傷組織黃酮提取的最佳條件:以40%乙醇為提取溶劑,液料比25∶1,在中火檔(528W)微波60s,黃酮得率最高,單次提取的黃酮得率達到20.92mg/g。這比很多文獻中銀杏葉片黃酮的得率明顯高一些,因為葉片中黃酮化合物總含量才20mg/g左右,單次提取的黃酮得率更低,如:18.38mg/g[4]、8.28mg/g[5]、12.91mg/g[6]。同時銀杏愈傷黃酮得率也高于銀杏外種皮,因為銀杏外種皮中總黃酮含量才12.15mg/g[11]。故利用銀杏愈傷組織生產黃酮具有一定的市場潛力。

本研究中,微波處理能顯著提高黃酮得率,這是因為微波處理能破壞細胞結構,同時微波處理附帶的熱效應也能增加黃酮溶出速率[12]。但是處理時間過長,往往會導致黃酮得率降低[5,13],這是因為微波長時間作用后產生高溫,導致以槲皮素為甙元的黃酮甙發生了分解[14]。本實驗中,微波處理采取每處理5s水浴冷卻一次的方法進行,避免了由微波處理導致溫度過高而破壞黃酮,所以微波處理時間增加有利于黃酮的提取,而且沒有出現時間過長導致黃酮被破壞。

實驗中,微波處理后的水浴浸提過程效果不明顯,從簡化工藝、降低能耗的角度出發,將水浴處理步驟從最終工藝中舍去。短暫的微波處理能代替長時間的水浴過程,這說明了微波提取法在銀杏愈傷組織黃酮提取中的高效性。

實驗中發現40%乙醇做提取劑時銀杏愈傷組織黃酮得率最高，而文獻中銀杏葉片黃酮提取需要較高的乙醇濃度,如:83%[4],63%[5]、72.95%[6]。這可能是因為愈傷組織中的黃酮糖苷親水性比葉片中的強,具體原因還有待于進一步的研究。

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Optimization of extracting conditions of flavonoids fromGingkoCallus by orthogonal experiment

LIANG Wen-hui,HUANG Xiang,LIN Li-chun,XIA Nian-yi,ZHANG Xun,PENG Chun-lin,QIU Tian,SHI Xiao-yu,DENG Xiang-yi*

(College of Food & Life Science and Technology,Chutian College Huazhong Agricultural University,Wuhan 430205,China)

UsingGinkgocallus as material,the optimization of the extraction conditions ofGinkgoflavonoids was done. Through single-factor tests,the influences of several factors on extraction rate ofGinkgoflavonoids were investigated,such as ethanol concentration,liquid-powder ratio,microwave power,microwave processing time,water bath temperature,water bath processing time,etc. Then,orthogonal test was carried out. The results of orthogonal experiment indicated that:using 40% ethanol as the extraction solvent,liquid-powder ratio 25∶1,microwave processing 60s under middle power level(528W),no water bath treatment,the extraction rate of flavonoids reached 20.92mg/g.

GingkoCallus;flavonoids;optimization of extraction conditions;orthogonal experiment;microwave process

2014-08-07

梁文惠(1987-)，女，在讀本科生，研究方向：植物細胞工程與天然活性產物提取。

*通訊作者:鄧祥宜(1984-)，男，碩士，講師，研究方向：植物細胞工程與天然活性產物提取。

國家級大學生科技創新項目(201314035001)；校級大學生科技創新項目(201201)。

TS205

B

:1002-0306(2015)09-0209-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.037