槲皮素體內外抑制人骨肉瘤細胞株143B增殖及其機制研究

江 波，李 燦，林 清，李瑞生

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槲皮素體內外抑制人骨肉瘤細胞株143B增殖及其機制研究

江 波，李 燦*，林 清，李瑞生

目的 研究槲皮素體內外對骨肉瘤143B細胞增殖的抑制作用及其作用機制。方法體外培養人骨肉瘤143B細胞，隨機分組，MTT法檢測細胞增殖抑制率；流式細胞術檢測凋亡率和細胞周期；建立143B細胞裸鼠異種移植瘤模型，隨機分為陰性對照組、5-Fu陽性對照組及槲皮素3個劑量組，每周給藥3次，4周后處死裸鼠，剝瘤，計算抑瘤率；采血，雙抗體夾心ABC-ELISA法測TNF-α和TGF-α的含量。結果槲皮素(10～320 μmol/L)體外可明顯抑制143B細胞的增殖，且具有濃度和時間依耐性；在40～160 μmol/L濃度下，槲皮素可誘導143B細胞凋亡；將細胞阻滯在G0-G1期；體內抑制腫瘤生長，提高血清TNF-α含量，降低TGF-α的含量。結論槲皮素抑制143B細胞的作用機制與誘導細胞凋亡和將細胞周期阻滯在G0～G1期，及增強機體免疫功能有關。

槲皮素；143B；增殖；凋亡；裸鼠；TNF-α；TGF-α

0 引言

骨肉瘤是常見的原發性骨惡性腫瘤之一，好發于青少年長骨干骺端，進展快，易復發，惡性程度高，預后差等[1-2]。目前采用新輔助化療法聯合免疫及基因治療能明顯改善患者預后[3]。但是骨肉瘤的發生和發展過程復雜，受多種因素的影響和制約，且對大多數化療藥物不敏感[4-5]。因此，尋找天然有效的抗腫瘤藥物，改善患者生存質量極其重要。

槲皮素是一種具有多種生物活性的天然的黃酮類化合物，具有顯著的抗氧化、抗血小板聚集、抗炎、抗病毒、調節免疫功能等作用[6-7]。已有研究發現，槲皮素對多種惡性腫瘤細胞均有抑制增殖和誘導凋亡的作用[8-10]，而目前槲皮素在抗骨肉瘤方面的報道較少。本實驗建立移植瘤模型裸鼠，考察其體內的抑瘤率，為進一步研究槲皮素抑制143B細胞增殖及誘導其凋亡的作用機制提供理論依據。

1 材料和儀器

骨肉瘤細胞株143B購于中國科學院上海細胞研究所；SPF級BALB/C-nu裸鼠，體重16～20 g，購于中國醫學科學院上海實驗動物繁殖中心，按SPF級要求管理；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；DMEM培養基(HyClone公司)；5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司)；MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)；ELx800型酶聯免疫檢測儀(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；流式細胞儀FACS Calibur(Becton Dickinson公司)；其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 細胞培養 將人骨肉瘤143B細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，用胰蛋白酶消化后按1∶3的比例傳代，每3天傳代1次，取處于對數生長期的細胞用于本實驗。

2.2 細胞增殖抑制率的測定 采用噻唑藍(MTT)還原法檢測細胞增殖抑制率。取處于對數生長期的143B細胞，制成1×105/mL細胞懸液，接種于96孔培養板中，每孔100 μL，培養24 h。將槲皮素溶解于DMEM培養液中，分別加入96孔培養板，使最終每組含槲皮素濃度分別為：10、20、40、80、160、320 μg/mL，每個濃度6個復孔，空白對照組加等量DMEM培養液。分別于24、48和72 h后各取出一塊板進行MTT比色實驗：將各孔中的上清液吸出100 μL棄去，加入MTT 10 μL(終濃度5 mg/mL)，繼續培養4 h后，加入DMSO 100 μL振蕩使沉淀充分溶解，用酶標儀于波長570 nm處讀取吸光度值(A)。按公式“(1-藥物孔A值/對照孔A值)×100%”計算細胞抑制率，以劑量和抑制率繪制生長曲線。

2.3 細胞凋亡和細胞周期的測定 采用流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期。按照試劑盒說明，將對數生長期的143B細胞調整密度為1×106/mL，接種于培養瓶中。24 h后隨機分組，分別加入槲皮素使終濃度為40、80、160 μg/mL，陽性對照組加入順鉑，對照組加入等體積的DMEM培養液，48 h后常規消化洗滌細胞，用70%預冷乙醇固定，置4 ℃環境待測凋亡率。檢測前，先離心棄上清，用PBS洗滌后置于檸檬酸緩沖液中1 h以上，然后調整細胞濃度至1×106/mL，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率并分析細胞周期。

2.4 制備模型、分組及給藥 將對數生長期的骨肉瘤143B細胞調整濃度為1×107/mL。取4～6周齡的BALB/C-nu裸鼠，將細胞于無菌條件下接種于左側背部皮內，致瘤后，無菌條件下以組織瘤塊移植傳代，4代后生物學特征穩定。以無菌技術取出皮下移植瘤，剪切后接種于裸鼠左側背部皮內，待5～7 d成瘤后將荷瘤裸鼠隨機分為5組，每組5只。陰性對照組ip給予生理鹽水，5-Fu陽性對照組ip 5-Fu 25 mg/kg、槲皮素3個劑量組分別按25、50、100 mg/kg ip給藥，每周給藥3次，每次0.2 mL，各組均連續給藥4周。

2.5 抑瘤率的檢測 取血后，脫頸椎處死裸鼠，剝取瘤塊，剔除其他組織后分析天平稱取瘤重量。計算各組平均瘤塊重量及抑瘤率。腫瘤抑制率(%)=[1-(治療組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)]×100%。

2.6 裸鼠血清TNF-α和TGF-α的測定 末次給藥24 h后眼眶靜脈叢采血，離心后取上清液分裝于EP管中。按照檢測試劑盒說明書采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測TNF-α的含量。建立標準曲線：設標準孔8孔，每孔加入樣品稀釋液100 μL，第一孔加標準品100 μL，混勻后吸出100 μL移至第2孔。如此反復對倍稀釋至第7孔，從第7孔吸出100 μL棄去，第8孔為空白對照。前7孔加入裸鼠血清100 μL，置于37 ℃反應120 min。用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，吸水紙拍干。每孔加入第一抗體工作液100 μL，混勻后置37 ℃反應60 min。再次洗滌4～6次，加入酶標抗體工作液100 μL，37 ℃反應60 min，洗板同前。加入底物工作液100 μL，37 ℃暗處反應5～10 min，再加入50 μL終止液混勻，酶聯免疫檢測儀于490 nm處測吸光度，繪制標準曲線，計算TNF-α含量。吸光度值的高低和細胞因子表達成正比。同法檢測TGF-α的含量。

3 結果

3.1 槲皮素對骨肉瘤143B細胞生長的抑制作用 于倒置顯微鏡下觀察發現，與空白對照組相比，槲皮素作用后的細胞排列稀疏，且隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，細胞密度逐漸減少。不同劑量的槲皮素對143B細胞的增殖均有抑制作用，各藥物組細胞生長抑制率與相對應的空白對照相比差異均有統計學意義(P<0.05)，隨著作用時間的延長，對細胞生長的抑制作用增強，由此可見，槲皮素體外對143B細胞的抑瘤作用呈現濃度和時間依賴性，見圖1。

圖1 槲皮素對143B細胞增殖的抑制作用

3.2 槲皮素對骨肉瘤143B細胞凋亡的影響 經流式細胞儀檢測發現，槲皮素可誘導骨肉瘤143B細胞凋亡。低、中、高3個濃度的槲皮素作用143B細胞后的細胞凋亡率分別為19.25%±5.04%、29.76%±5.20%、31.98%±6.18%，明顯高于對照組，隨著劑量的增加，凋亡率增加，見表1。

表1 槲皮素對143B細胞凋亡的影響(n=3)

3.3 槲皮素對骨肉瘤143B細胞周期的影響 槲皮素作用于143B細胞48 h后，細胞周期均受到不同程度的影響，與對照組相比，三個劑量組的G0～G1期細胞比例均增加，與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，G0-G1期比例的增加與濃度無關；S期和G2-M期略有減少，但與對照組之間差異無統計學意義。提示槲皮素可通過將細胞周期阻滯在G0-G1期從而抑制骨肉瘤細胞的生長，見表2。

表2 槲皮素對143B細胞周期的影響(n=3)

3.4 槲皮素對荷瘤裸鼠瘤重量的影響 實驗結果顯示，給藥4周后，5-Fu(25 mg/kg)對荷瘤裸鼠瘤重量的生長有明顯的抑制作用，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.001)；槲皮素3個劑量組(25、50、100 mg/kg)皆可不同程度抑制荷瘤裸鼠瘤重量的增加，與模型組相比差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.05)，且抑瘤率呈現劑量依賴性，見表3。

表3 槲皮素對荷瘤裸鼠瘤重量的影響(n=5)

3.5 槲皮素對荷瘤裸鼠血清TNF-α和TGF-α含量的影響 模型組裸鼠TNF-α含量低于正常對照組，TGF-α含量高于正常對照組(P<0.01)；5-Fu(25 mg/kg)能夠提高荷瘤裸鼠的TNF-α含量(P<0.01)，降低TGF-α含量(P<0.01)；槲皮素在25、50 mg/kg劑量下，可提高荷瘤小鼠的血清TNF-α含量，以高劑量效果較好(P<0.05)；槲皮素3個劑量均可降低荷瘤裸鼠血清TGF-α的含量，以中劑量效果最好(P<0.05)，見表4。

表4 槲皮素對荷瘤裸鼠血清TNF-α和TGF-α含量的影響(,n=6)

4 討論

細胞增殖主要受細胞周期和凋亡兩個因素的影響。細胞凋亡過多或過少均會引發多種疾病[11]。誘導腫瘤細胞凋亡已成為現代腫瘤藥物治療的新策略[12]。槲皮素是一種廣泛存在于自然界的黃酮類化合物，具有多種生物活性[13]。國內外已有的研究表明，其在保護細胞減少氧化應激的損害、緩解免疫損傷、促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞增殖中發揮了重要作用，且槲皮素作為天然藥物，其抗腫瘤作用具有選擇性，在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常細胞的毒性極其微弱[14]。

本實驗采用MTT法及流式細胞術檢測槲皮素體外對人骨肉瘤143B細胞的抗瘤效果，結果表明，槲皮素能夠明顯抑制143B細胞的生長，誘導其凋亡，使細胞周期阻滯在G0～G1期，隨著藥物濃度增高和作用時間的延長，槲皮素對人骨肉瘤143B細胞增殖的抑制率也增加，細胞形態發生明顯改變，由此可見，槲皮素對143B細胞的抑制作用具有量效和時效關系。

裸鼠異種移植瘤模型是腫瘤實驗中廣泛應用的腫瘤動物模型。本實驗結果顯示，建立143B細胞裸鼠移植瘤模型，給藥4周后，腫瘤生長明顯受到抑制，隨著給藥劑量的增加，瘤塊體積逐漸減小，低、中、高3個劑量組槲皮素的抑瘤率分別為28.64%、39.68%和51.20%，提示槲皮素體內可明顯抑制骨肉瘤的生長，作用呈現劑量依賴性。

TNF-α屬腫瘤壞死因子家族，主要由活化的單核-巨噬細胞分泌，也可由NK細胞、T細胞產生和釋放。TNF-α是具有多種生物效應的細胞因子，機體內適量的TNF-α在腫瘤防御中起著重要作用，能夠激活T淋巴細胞，刺激機體產生抗體和細胞因子，直接殺傷腫瘤細胞而對機體正常細胞無毒性；也可通過提高機體的免疫功能而發揮抗腫瘤作用；還可誘導多種不同類型的腫瘤細胞凋亡，其對腫瘤發生機制具有十分重要的研究價值[15-18]。TGF-α可與表皮生長因子受體(EGFR)結合，激活MAPK信號系統，促使DNA合成，從而促使腫瘤細胞在失控狀態下不斷增殖和分化，進而發生癌變[19-20]。TGF-α表達程度與腫瘤的惡性程度之間呈線性關系。本研究結果顯示，荷瘤模型裸鼠血清TNF-α水平明顯降低，TGF-α水平明顯升高，說明裸鼠荷瘤以后，其免疫功能受到抑制，而在行槲皮素給藥后，荷瘤裸鼠血清TNF-α水平顯著升高，TGF-α水平明顯降低，提示槲皮素可通過上調血清TNF-α水平或/和下調TGF-α水平，增強荷瘤機體的免疫功能，進而達到抑制骨肉瘤的目的。

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Effect of quercetin on tumor growth in human osteosarcoma cell line 143Binvivoandinvitroand its mechanism

JIANG Bo,LI Can*,LIN Qing,LI Rui-sheng

(Xiangyang Central Hospital Affiliated to Hubei University of Arts and Science,Xiangyang 441021,China)

Objective To study the influence of apoptosis and apoptosis pathway on human osteosarcoma 143B cells by quercetin.Methods143B cells were culturedinvitro,and MTT was performed to observe the proliferation.Flow cytometry was utilized for measuring the apoptosis and cell cycle.After subcutaneous implantation of the 143B cells,the tumor-bearing nude mice were randomized into control group,5-Fu group,three doses quercetin groups.The medication groups were given the corresponding drugs.After 4 weeks,the tumor was peeled off and tumor-inhibition rate was counted.The expression of TNF-α and serum TGF-α was determined by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsQuercetin could inhibit the proliferation of 143B cellsinvitroat 10～320 μmol/L,which was concentration- and time-dependence.At a dosage of 40～160 μmol/L in cultured cells,the apoptosis rates was elevated,and cell cycle was blocked in G0～G1phase.Quercetin was able to inhibit the tumor growth in a dose-dependent manner,inhibited the expression of TGF-α,and promoted the expression of TNF-α.ConclusionQuercetin can inhibit the growth of 143Binvitroandinvivo,the mechanism of anti-tumor effect relates to inducing apoptosis,arresting cell cycle at the G0～G1phase,and enhancing immune function.

Quercetin; 143B; Proliferation; Apoptosis; Nude mice; TNF-α; TGF-α

2014-06-09

湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院，湖北 襄陽 441021

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201505004