苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對HepG2人肝癌細胞的凋亡誘導效果

周雅琳,馮 霞,朱 凱,趙 欣

(重慶第二師范學院 生物與化學工程系,重慶 400067)

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苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對HepG2人肝癌細胞的凋亡誘導效果

周雅琳,馮 霞,朱 凱,趙 欣*

(重慶第二師范學院 生物與化學工程系,重慶 400067)

茶多酚是茶葉中的功能性成分。蟲茶作為傳統飲品也含有這些化合物,這些多酚類物質的抗癌效果有待科學的研究。本研究對苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)的癌細胞凋亡誘導作用進行了測定。采用MTT法對CPKMI對癌細胞的體外生長抑制作用進行了分析,然后進一步采用RT-PCR檢測對CPKMI的癌細胞凋亡誘導效果進行了實驗。經過25、50和100μg/mL的CPKMI處理癌細胞48h,HepG2人肝癌細胞的增殖被抑制,其中100μg/mL的CPKMI表現出最高的抑制率(72.8%)。CPKMI也可以通過上調caspase-3、caspase-9、p53、p21、E2F1、p73和下調HIAP-1,HIAP-2基因的mRNA的表達對HepG2癌細胞起到顯著的凋亡誘導效果(p<0.05)。由此可見,CPKMI表現出強的體外癌細胞凋亡誘導效果。

蟲茶,苦丁茶,凋亡,HepG2人肝癌細胞

肝癌在我國是發病率高的惡性疾病,治療困難,患者死亡率高。現階段對肝癌的治療缺乏根治的有效手段,多采用早發現、早診斷和早治療來降低患者死亡率。中醫以提高人體免疫力來達到預防和治療癌癥的效果,食品中的有效提取物已經被證實具有一定的抗癌功效,包括茶多酚[1]。飲用茶水來預防肝癌,針對肝癌患者也可以通過攝取茶葉中的多酚類物質協助西醫的手術和化療等治療手段。

蟲茶是一種特殊的飲品,并不是真正的茶葉,不屬于傳統意義上的茶葉,僅沖泡方式和飲用方式與傳統茶葉相同,同時蟲茶具有很強的民族特色,產地多在少數民族聚居的貴州、湖南、廣西、四川和云南等邊遠地區[2]。當地居民采集野生的苦丁茶葉和化香樹葉等多種野生植物的鮮嫩葉,蒸煮后除去葉片的澀味,將曬干的葉片淋上淘米水后分層堆放在木桶或者竹筐里,葉片輕微自然發酵后散發香氣,香氣吸引化香夜蛾等昆蟲在葉片中產卵,孵化出的幼蟲取食葉片后排出的蟲糞顆粒,收集的蟲糞顆粒再經暴曬和炒制等工藝得到蟲茶產品[3]。苦丁茶具有多種保健功效,包括預防癌癥[4]。苦丁茶中的多酚類物質有多種保健功能[5]。本文對以苦丁茶為原料制作的蟲茶粗多酚為材料,考察其對人肝癌細胞的誘導凋亡作用,為開發蟲茶抗癌功能食品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蟲茶 為貴州產苦丁茶葉制蟲茶。HepG2人肝癌細胞 購自于美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)。RPMI-1640細胞培養液、胎牛血清和MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)、DMSO(二甲亞砜) 美國Sigma公司；CycleTESTTM PLUS DNA染色試劑盒 德國Becton Dickinson公司；Trizol試劑、oligodT18、RNase、dNTP、MLV 美國Invitrogen公司；RT-PCR(反轉錄聚合酶鏈式反應)引物caspase-3、caspase-9、HIAP-1、HIAP-2、p53、p21、E2F1、p73 德國Eppendorf公司；其余試劑均為國產分析純。

EYELA N-1001S旋轉蒸發儀 日本東京理化器械株式會社；UV-1750型紫外分光光度計 日本島津公司；Thermo 3110二氧化碳細胞培養箱 美國Thermo公司；Combi-514R冷凍離心機 韓國Hanil株式會社；Bio-Rad 680酶標儀、Bio-Rad小型水平電泳槽 美國Bio-Rad公司；ABI 2720 PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)的提取 蟲茶樣品冷凍干燥后打粉。按文獻方法[5],稱取50g打粉后的蟲茶,加入體積比為45%的乙醇溶液50mL,水浴90℃下浸提30min浸提2次,合并2次浸提液后調節pH到6,加入80mL混合沉淀劑(10g AlCl3和20g ZnCl2溶于270mL水中)沉淀后在3000r/min下離心分離10min,在沉淀中加入12%鹽酸100mL,分離上清液。在上清液中加入100mL乙酸乙酯萃取后再重復操作萃取一次,合并兩次萃取液后旋轉蒸發得到苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)提取物。

1.2.2 CPKMI中多酚物質的含量測定 采用酒石酸亞鐵比色法,將綠原酸溶于蒸餾水中制成不同的綠原酸溶液,取1mL綠原酸溶液,加入5mL酒石酸亞鐵溶液,再用pH為7.5的磷酸緩沖液定容到25mL,通過在540nm處測得的吸光值繪制標準曲線。CPKMI采用相同的方法測定多酚含量[6]。

1.2.3 CPKMI對HepG2人肝癌細胞生長抑制率測定 利用MTT法,用含10%胎牛血清的RPMI-1640細胞培養液將HepG2人肝癌細胞在37℃,5% CO2細胞培養箱中培養,每2～3d更換一次培養液。將癌細胞濃度調整為1×105個/mL后按每孔100μL將細胞懸液于接種于96孔板中,癌細胞貼壁培養24h后,吸去孔內培養液,再在孔中加入100μL濃度分別為25、50和100μg/mL的CPKMI的培養液繼續培養48h,然后吸出孔內培養液,加入0.5mg/mL的MTT試劑的培養液混合液100μL再培養4h。最后再次吸出孔內培養液,在孔中加入100μL的DMSO后室溫避光放置30min,然后在540nm處測定OD值,通過計算OD值可得到細胞生長抑制率(%)=[(OD樣品-OD對照)/ OD對照]× 100[7]。

1.2.4 RT-PCR法檢測粗茶多酚對人肝癌細胞基因表達的影響 將人肝癌HepG2細胞接種于直徑為10cm細胞培養皿中,按細胞生長抑制實驗的方法進行細胞培養和樣品處理后用RNAzol試劑提取樣品處理后HepG2細胞的總RNA。將提取的總RNA濃度調整至1μg/μL。取2μL的RNA提取液分別加入oligodT18、RNase、dNTP和MLV酶各1μL,5×buffer 10μL,在37℃120min,99℃ 4min,4℃ 3min的條件下合成cDNA。然后以反轉錄-聚合酶鏈反應法擴增caspase-3、caspase-9、HIAP-1、HIAP-2、p53、p21、E2F1和p73表達,同時以持家基因作為對照內參照。最后以含濃度溴化乙錠的1%瓊脂電泳檢查PCR擴增產物[8]。

1.3 數據統計

對實驗進行重復實驗3次,得到的結果以平均值±標準偏差表示后使用SAS統計軟件對所得數據采用one-way ANOVA法分析數據結果在p<0.05水平上是否具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚中的多酚含量

通過酒石酸亞鐵比色法對CPKMI的多酚含量進行測定,觀察到CPKMI中多酚(綠原酸計)的含量為41.27%,結合提取前取樣量,可計算出苦丁茶葉制蟲茶中多酚含量為12.35%,可見本研究中提取方法可以明顯的提高提取物中的多酚含量,提取出的粗多酚物質可以用以檢測其對癌細胞的體外凋亡誘導效果。

2.2 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對HepG2人肝癌細胞的體外增殖抑制效果

在體外抗癌實驗中使用MTT法可以觀察待測樣品對癌細胞體外增殖的影響,其結果可以作為樣品抗癌效果的初步依據[8]。由實驗結果可知,CPKMI對體外培養的HepG2細胞有顯著的抑制作用,CPKMI濃度在25μg/mL下對癌細胞的抑制率為17.0%,濃度為50μg/mL時,抑制率為52.5%(p<0.05),濃度為100μg/mL時,抑制率為72.8%(表1)。可見CPKMI對HepG2人肝癌細胞的生長抑制呈現量效關系。

表1 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)對HepG2人肝癌細胞的體外增值抑制效果Table1 Growth inhibitory effect of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves(CPKMI)in HepG2 human hepatoma cells

注:a-d不同字母表示各組數據平均值顯著性差異(p<0.05)。

2.3 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對HepG2細胞caspase-3和caspase-9基因表達的影響

Caspase是一類蛋白酶,參與細胞的生長和凋亡控制。其中Caspase-9是細胞凋亡信號轉導過程的一個上游的caspase,caspase-3是一個下游的caspase,它們都是細胞凋亡效應中的效應分子[9]。Caspase-9是線粒體通道的細胞凋亡效應分子,被活化后,啟動細胞內的死亡程序,激活下游的caspase-3將凋亡信號放大并執行,導致細胞出現凋亡,有研究表明,隨著外界功能性物質的刺激,體外培養的癌細胞的caspase-3和caspase-9表達強度將上升[10]。本研究表明,CPKMI作用在體外培養的HepG2細胞后,癌細胞caspase-3和caspase-9的mRNA表達較未經過處理的癌細胞有明顯上升(圖1),且濃度越大,上升的幅度越大,可見CPKMI可以上調HepG2肝癌細胞caspase表達,誘導癌細胞凋亡。

圖1 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)對HepG2人肝癌細胞的caspase-3和caspase-9基因表達的影響Fig.1 Effect of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves(CPKMI)on the gene expressions of caspase-3 and caspase-9 in HepG2 human hepatoma cells

2.4 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對HepG2細胞HIAP-1和HIAP-2基因表達的影響

HIAP-1和HIAP-2均是凋亡抑制基因,能夠抑制caspase酶原達到減弱誘導凋亡的效果[11]。因此,控制和削弱HIAP-1和HIAP-2在腫瘤細胞中的影響,有利于激活caspase,充分發揮誘導癌細胞凋亡的作用[12]。在100μg/mL濃度下較對照癌細胞CPKMI可以明顯地抑制和降低HIAP-1和HIAP-2的表達,25μg/mL和50μg/mL濃度的CPKMI也能不同程度的降低HIAP-1和HIAP-2的表達強度(圖2)。由此可見CPKMI可以控制HepG2癌細胞中的HIAP-1和HIAP-2基因,從而達到加強caspase活性的目的,誘導癌細胞凋亡。

圖2 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)對HepG2人肝癌細胞的HIAP-1和HIAP-2基因表達的影響Fig.2 Effect of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves(CPKMI)on the gene expressions of HIAP-1 and HIAP-2 in HepG2 human hepatoma cells

2.5 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對HepG2細胞p53和p21基因表達的影響

p53是一種與癌癥關系最為密切的抗致癌基因,p53基因參與調控修復細胞受損的DNA,細胞DNA不能修復時,p53就會誘導癌細胞凋亡[13]。p53還通過參與線粒體介導的細胞凋亡過程,起到促進細胞凋亡的效果,caspase誘導細胞凋亡的過程中如果失去p53,誘導凋亡的過程將被大幅度限制[14]。p21基因在誘導細胞凋亡的過程中與p53有一定關聯,p21同樣能促進癌細胞的凋亡[15]。在本實驗中,對體外培養的HepG2癌細胞分別采用25、50和100μg/mL濃度的CPKMI進行處理,可以看到三個濃度作用下,癌細胞中的p53和p21基因表達均隨著CPKMI濃度升高表達強度也隨之上調,對濃度的依賴性呈正相關(圖3)。實驗結果進一步說明CPKMI可以影響HepG2癌細胞凋亡,能夠有效的促進癌細胞的凋亡誘導過程。

圖3 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)對HepG2人肝癌細胞的p53和p21基因表達的影響Fig.3 Effect of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves(CPKMI)on the gene expressions of p53 and p21 in HepG2 human hepatoma cells

2.6 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚對HepG2細胞E2F1和p73基因表達的影響

E2F1能夠特異性誘導癌細胞凋亡,高表達E2F1可以刺激癌細胞進入細胞分裂間期的DNA合成期(S期),然后誘導癌細胞凋亡,并且E2F1還可以通過提高p53基因的穩定性或刺激p53基因而直接促進p53基因的誘導凋亡過程[16]。同時,高表達的E2F1也可以通過p73基因誘導細胞凋亡,p73基因能單獨的被E2F1激活和誘導細胞凋亡而不需要p53基因的支持[17]。由其他研究的結果可知,上調E2F1和p73基因的表達強度可以更好的誘導癌細胞凋亡,100μg/mL的CPKMI刺激HepG2癌細胞后,細胞中的E2F1和p73基因表達強度很強(圖4),即CPKMI也可以通過加強細胞中的E2F1和p73基因表達來達到誘導癌細胞凋亡。

圖4 苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)對HepG2人肝癌細胞的E2F1和p73基因表達的影響Fig.4 Effect of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves(CPKMI)on the gene expressions of E2F1 and p73 in HepG2 human hepatoma cells

3 結論

本研究對苦丁茶葉制蟲茶粗多酚(CPKMI)的抗肝癌活性進行了初步研究。發現CPKMI對HepG2人肝癌細胞有顯著的抑制作用。CPKMI可以上調caspase-3、caspase-9、p53、p21、E2F1、p73的表達,下調HIAP-1、HIAP-2的表達。表明CPKMI可以從多種基因途徑誘導HepG2人肝癌細胞凋亡。本研究表明,CPKMI有望作為一種抗癌功能性食品的原料,其體內的抗癌活性有待進一步研究。

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Apoptosis inducing effects of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves in HepG2 human hepatoma cells

ZHOU Ya-lin,FENG Xia,ZHU Kai,ZHAO Xin*

(Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China)

Tea polyphenols are functional substances present in tea. Insect tea as a traditional drink also contains these compounds,the anticancer effects of these polyphenols need to be scientific researched. In this study,cancer cells apoptosis inducing effects of crude polyphenols of Insect tea made by Kuding tea leaves(CPKMI)were determined. Theinvitrocancer cells growth inhibitory effects of CPKMI were checked by MTT assay,the apoptosis inducing effects of CPKMI were further tested by RT-PCR assay. After 25,50 and 100μg/mL of CPKMI treatment for 48h,cell proliferation of HepG2 human liver cancer cells were inhibited,and the 100μg/mL of CPKMI showed the highest inhibitory rate at 72.8%. CPKMI also significantly induced apoptosis in HepG2 cancer cells(p<0.05)by upregulating caspase-3,caspase-9,p53,p21,E2F1,p73 and down regulating HIAP-1,HIAP-2 mRNA expressions. CPKMI thus present strong cancer cells apoptosis inducing effectsinvitro.

Insect tea;Kuding tea;apoptosis;HepG2 human hepatoma cell

2014-07-24

周雅琳(1976-)，女，博士，副教授，高級工程師，研究方向：食品科學。

*通訊作者:趙欣(1981-),男，博士，教授，主要從事食品專業相關課程教學，及食品營養、食品功效和藥食同源產品特性等領域研究工作。

重慶市教委科學技術研究項目(KJ1401402)。

TS201.1

A

:1002-0306(2015)09-0339-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.065