迎春花總黃酮的生物活性研究

侯 蓓,趙成愛,*,韓 璐,馬炳陽,徐偉強,盧 澤

(1. 吉林農業大學 資源與環境學院,吉林長春 130118 2. 延邊大學 理學院,吉林延吉 133002)

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迎春花總黃酮的生物活性研究

侯 蓓1,趙成愛1,*,韓 璐1,馬炳陽1,徐偉強1,盧 澤2

(1. 吉林農業大學 資源與環境學院,吉林長春 130118 2. 延邊大學 理學院,吉林延吉 133002)

目的:對迎春花粗分離各萃取相中總黃酮抗氧化活性進行研究。方法:通過各萃取相中總黃酮對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除作用以及總還原力的測定來研究其抗氧化活性。選出抗氧化性最好的萃取相對D-半乳糖誘導的小鼠進行抗衰老實驗,對MDA、SOD、CAT、POD、GSH、Hyp指標進行檢測。結果:迎春花各萃取相對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除以及總還原力均有較強的作用,其中乙酸乙酯相在清除DPPH自由基達到98%,并在小鼠抗衰老實驗中,乙酸乙酯相能有效提高衰老小鼠的SOD、CAT、POD以及GSH活性,MDA、Hyp含量降低。結論:通過體外抗氧化實驗確定了迎春花乙酸乙酯相抗氧化能力最強,并在小鼠體內實驗中確定了乙酸乙酯相具有較強的抗衰老能力。

迎春花,總黃酮,抗氧化,抗衰老

迎春花(JasminumnudoiflorumLindl.)為木樨科茉莉屬落葉灌木,原產于我國中部和北部各省,現各地均有栽培。迎春花具有解熱發汗、利尿、活血散毒、消腫止痛等功效[1]?，F代研究證明迎春花中含有豐富的黃酮類化合物[2],它具有諸多生物活性,如抗氧化、降血脂、降血壓、抑制血小板聚集及血栓的形成、抗肝臟病毒、抗炎抗菌等[3],尤其是抗氧化性。張志信等[4-5]研究了迎春花的花、葉、莖中黃酮類化合物及其不同季節含量,3至4月間花中含量最高;鄭敏燕等[6-7]研究了迎春花葉總黃酮提取物對豬油的抗氧化性能,發現迎春花葉總黃酮提取物有較強的抗氧化性;回瑞華等[8]采用了化學發光法研究了迎春花黃酮類化合物的抗氧化性。目前,還未發現對迎春花總黃酮體內實驗的文獻記載,本實驗不僅對迎春花各萃取相的總黃酮進行測定,并對各萃取相進行了體外抗氧化實驗,還對乙酸乙酯相進行了小鼠的體內實驗。

本實驗首先通過各萃取相及總提取物對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除以及總還原力這四個指標進行抗氧化活性分析,并選出抗氧化性最強的萃取相對D-半乳糖誘導小鼠衰老進行抗衰老實驗,旨在為迎春花的抗氧化生物活性研究及開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

迎春花 購買于安徽亳州中藥材市場,由吉林農業大學中藥材學院楊利民教授鑒定,粉碎機粉碎,備用;蘆丁標準品(含量≥95%) 國藥集團化學試劑有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等,均為分析純。D-半乳糖(M&C Gene Technology)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)ELISA試劑盒 R&D Systems產品。

JFSD-100粉碎機 上海淀久中藥機械制造有限公司;KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RE-2000旋轉蒸發器、SHZ-III型循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;TDL-5A低速大容量離心機 上海悅豐儀器儀表有限公司;Infinite M200 PRO酶聯免疫檢測分析儀 NanoQuant。

1.2 實驗方法

1.2.1 迎春花總黃酮的提取及測定 通過預實驗可知,采用超聲波法輔助提取迎春花總黃酮,提取條件為乙醇體積分數68%、液料比20∶1、提取時間40min、提取溫度50℃。

總黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3的比色法。以蘆丁作為標準品,510nm處測其吸光度,以吸光度(A)為縱坐標,質量濃度(C)為橫坐標,繪制標準曲線,得線性回歸方程:A=11.779C+0.0072,R2=0.9996。

式中:C為比色皿中測量液的總黃酮濃度,mg/mL;V1為測量液的定容體積,10.00mL;V2為測量時量取的體積,1.00mL;V3為提取液的定容體積,50.00mL;m為迎春花干粉的質量,1000.00mg。

1.2.2 迎春花粗分離 取100.00g迎春花提取物浸膏,加200.00mL蒸餾水溶解,得到懸浮液,分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取五次,得到萃取液,濃縮至浸膏。

1.2.3 迎春花各萃取相體外抗氧化能力的測定 迎春花各萃取相對DPPH自由基清除能力的測定:精確稱取0.0100g DPPH,用無水乙醇溶解,移至250.00mL棕色容量瓶,定容至刻度,配制濃度為0.04mg/mL的DPPH溶液。分別取2.00mL不同濃度各萃取相的溶液,加入2.00mL DPPH溶液,混合均勻,室溫避光放置30min,無水乙醇做參比液于517nm處測吸光度值,用VC作為陽性對照。以上方法重復3次取平均值[9-11]。樣品對DPPH自由基的清除率用以下公式計算:

式中:A0-2.00mL無水乙醇+2.00mL DPPH溶液的吸光度值;A1-2.00mL樣品溶液+2.00mL DPPH溶液的吸光度值;A2-2.00mL樣品溶液+2.00mL無水乙醇的吸光度值。

迎春花各萃取相對羥基自由基清除能力的測定:反應體系中含8.80mmol/L H2O21.00mL、9.00mmol/L FeSO41.00mL、9.00mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.00mL,不同濃度的樣品溶液1.00mL。最后加H2O2啟動反應,37℃反應15min,蒸餾水作參比,在510nm下測定各濃度的吸光度。以9.00mmol/L FeSO4、9.00mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、不同濃度的樣品溶液和蒸餾水各1.00mL作為樣品的本底吸收值,VC作為陽性對照[12]。實驗重復三次取平均值。

按下式計算·OH清除率:

式中:A0-1.00mL蒸餾水+1.00mL H2O2溶液+1.00mL FeSO4溶液+1.00mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度值;Ax-1.00mL樣液+1.00mL H2O2溶液+1.00mL FeSO4溶液+1.00mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度值;Ax0-1.00mL蒸餾水+1.00mL樣液+1.00mL FeSO4溶液+1.00mL水楊酸-乙醇溶液的吸光度值。

迎春花各萃取相對超氧陰離子自由基清除能力的測定:取5.00mL 50.00mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.2),于25℃水浴中保溫20min,分別加入2.00mL樣品溶液和1.00mL 25.00mmol/L鄰苯三酚溶液,混勻后于25℃水浴中反應5min,加入1.00mL 10.00mmol/L HCl終止反應,于420nm處測定吸光度(Ax),以Tris-HCl緩沖液做參比,空白對照組以相同體積蒸餾水代替樣品,VC作為陽性對照[13-14]。實驗重復三次取平均值。

式中:A0-空白對照液吸光度;Ax-樣品溶液吸光度。

迎春花各萃取相對總還原力測定:于13.00mL離心管中分別加入0.20mol/L pH6.6的磷酸緩沖液2.00mL和不同濃度的樣液2.00mL,加入2.00mL 1%鐵氰化鉀,混合均勻后于50℃反應20min。取出后加入2.00mL10%三氯乙酸終止反應,4000r/min離心10min。取上清液5.00mL,加入5.00mL蒸餾水和1.00mL0.1%的 FeCl3,混勻后靜置10min,以蒸餾水為參比溶液,在700nm處檢測吸光值,VC作為陽性對照[15]。實驗重復三次取平均值。

1.2.4 迎春花乙酸乙酯相體內抗衰老實驗 迎春花乙酸乙酯相對D-半乳糖誘導小鼠衰老模型的分組、建立和標本處理:

動物分組:取體重22～25g健康雄性ICR小鼠,實驗條件下飼養一周,采用隨機數字表取60只ICR小鼠隨機分為6組:空白對照組(A組)、模型對照組(B組)、給藥組100mg/kg(C組)、給藥組200mg/kg(D組)、給藥組300mg/kg(E組),每組10 只小鼠。

造模:實驗開始每天對B、C、D、E組小鼠背部皮下進行D-半乳糖(500mg/kg)注射,A組用注射等劑量的生理鹽水。連續造模60d。

給藥:15d后,C、D、E組灌胃給予迎春花乙酸乙酯相化合物(體重的0.1%),A、B組使用0.4%生理鹽水給以灌胃(體重的0.1%)。每日1次,連續45d。每3d稱一次體重,記錄體重。

小鼠的處理:實驗60d,眼眶靜脈取血,將取得血液于3500r/min的4℃冷凍離心機中,分離出血清,-20℃保存待用。取小鼠背部皮膚,用 8%硫化鈉溶液去除毛發,稱重后,放于錫紙上,包裹封袋,-20℃冰柜保存待用。取上清液用于MDA、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)、羥脯氨酸(Hyp)檢測。

MDA、SOD、CAT、POD、GSH以及Hyp含量的測定:將取得血液于3500r/min的4℃冷凍離心機中,分離出血清,用于MDA、SOD、CAT、POD、GSH含量的測定。將4℃的生理鹽水與皮膚組織1∶9研磨成組織勻漿,于3500r/min的4℃冷凍離心機中分離,取上清液,用于MDA、SOD、CAT、POD、GSH、Hyp的測定。

MDA、SOD、CAT、POD、GSH、Hyp檢測按照ELISA試劑盒說明進行。

2 結果與分析

2.1 各萃取相總黃酮含量的測定

由表1可知,各萃取相中總黃酮含量為:乙酸乙酯相>正丁醇相>總提取物>氯仿>石油醚,各萃取相中均含有黃酮類化合物,但乙酸乙酯相總黃酮含量最高,達到0.0615mg/mL。

表1 迎春花各萃取相中總黃酮含量Table1 The total flavonoids of different extractions from Jasminum nudoiflorum Lindl

2.2 體外抗氧化活性

2.2.1 各萃取相對DPPH自由基的清除能力 由圖1可以看出,在樣品濃度為0.1mg/mL時,總提取物、氯仿相、乙酸乙酯相清除DPPH自由基的能力比陽性對照VC略高;當濃度達到0.3mg/mL時,總提取物、氯仿相、乙酸乙酯相清除DPPH自由基的能力與陽性對照VC相同,達到98%;當濃度大于0.3mg/mL時,其清除率一直保持在98%不變。石油醚相和正丁醇相比總提取物、氯仿相、乙酸乙酯相清除略低,但在濃度增大時,清除自由基的能力也隨之增大;當濃度小于0.5mg/mL時,石油醚相的清除率比正丁醇相要低,但石油醚相清除率的增長速率最快;當濃度達到0.5mg/mL時,石油醚相和正丁醇相清除力相同,當濃度大于0.5mg/mL時,均趨于平緩。該圖說明迎春花各萃取相均對DPPH自由基具有較強的清除能力。

圖1 迎春花各萃取相對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging rates of different extractions from Jasminum nudoiflorum Lindl

2.2.2 各萃取相對總還原力的測定 由圖2可知,總還原力能力是VC>乙酸乙酯相>總提取物>正丁醇相>氯仿相>石油醚相,當濃度為0.1mg/mL時,乙酸乙酯相的吸光度略高于VC,當濃度達到0.3mg/mL時,VC吸光度值達到最大,之后基本保持不變;乙酸乙酯相的吸光度值隨著濃度的增大而增大。

圖2 迎春花各相還原能力測定Fig.2 Reducing power of different extractions from Jasminum nudoiflorum Lindl

2.2.3 各萃取相對羥基自由基的清除能力 由圖3可知,隨著樣品濃度的增大,各萃取相清除羥基自由基的能力也隨之增大,樣品的濃度與清除率成線性關系,VC的清除率最高,各萃取相清除羥基自由基的能力為乙酸乙酯相>正丁醇相>總提取物>氯仿相>石油醚相,乙酸乙酯相清除率最高達到75%以上,由此可以看出,迎春花的各萃取相對羥基自由基有較強清除能力。

圖3 迎春花各相對羥基自由基的清除作用Fig.3 Hydroxyl free radicals scavenging activity of different extractions from Jasminum nudoiflorum Lindl

2.2.4 各萃取相對超氧陰離子自由基清除能力 由圖4可知,VC的清除率最高,達到80%以上,其他各萃取相均隨著樣品濃度的增加,清除率越來越高,各萃取相清除超氧陰離子的能力為乙酸乙酯相>正丁醇相>總提取物>氯仿相>石油醚相,由此表明,各萃取相對超氧陰離子也具有較強的清除能力。

表2 乙酸乙酯相對D-半乳糖誘導小鼠衰老的體重影響Table2 Effect of ethyl acetate phase on aging mice induced by

注:*p<0.05,**p<0.01,與模型對照組作比較。表3～表5同。

表3 乙酸乙酯相對小鼠血清指標的影響Table3 Effect of ethyl acetate phase on serum index in mice

表4 乙酸乙酯相對小鼠皮膚組織指標的影響Table4 Effect of ethyl acetate phase on skin tissue parameters in mice

圖4 迎春花各相對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.4 Superoxide anion free radicals scavenging activity of different extractions from Jasminum nudoiflorum Lindl

2.3 體內抗衰老實驗

2.3.1 小鼠的體重增長率的測定 由表2可知,與空白對照組(A組)比較,模型對照組(B組)的小鼠體征為毛發枯黃無光、呆滯嗜睡,飲食量較少,體形消瘦,體重增長的緩慢,給藥組隨濃度的增大,小鼠體重的增長率逐漸增大。這些現象都與衰老小鼠特征相符[16]。

2.3.2 MDA、SOD、CAT、POD以及GSH含量的測定結果 超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)是抗氧化系統中重要的抗氧化酶,是生物體產生的天然抗氧化酶,它能清除體內超氧化物自由基,防止氧自由基對機體直接或間接的損傷,阻斷脂質過氧化連鎖反應,從而起到保護機體勉受氧自由基損傷的作用[17]。MDA 為脂質過氧化反應的產物,能引起細胞的損傷,MDA 含量升高說明機體脂質過氧化反應較多,因而氧自由基損傷就多[18-19]。

由表3可知,連續注射D-半乳糖60d后,模型對照組血清SOD、CAT、POD以及GSH活性均有所降低,均顯著低于正常對照組(p<0.05),而MDA含量高于正常對照組。隨著給藥濃度的增大,小鼠血清SOD、CAT、POD及GSH含量逐漸升高,且與模型對照組差異性顯著(p<0.05,p<0.01);MDA的含量逐漸降低,但與模型對照組差異性不顯著(p>0.05)。表明迎春花乙酸乙酯相可提高小鼠血清SOD、CAT、POD以及GSH活性,能抑制小鼠血清MDA含量的上升。

由表4、表5可知,連續注射D-半乳糖60d后,模型對照組皮膚組織中SOD、CAT、POD以及GSH活性均有所降低,均顯著低于正常對照組(p<0.05),而MDA、Hyp含量高于正常對照組。隨著給藥濃度的增大,小鼠血清SOD、CAT、POD及GSH含量逐漸升高,且與模型對照組差異性顯著(p<0.05,p<0.01);MDA的含量逐漸降低,但差異不顯著(p>0.05),Hyp含量也逐漸降低并且高劑量組效果顯著(p<0.05)。表明乙酸乙酯相可提高小鼠皮膚組織SOD、CAT、POD以及GSH活性,能抑制小鼠皮膚組織MDA、Hyp含量的上升。

表5 乙酸乙酯相對小鼠皮膚組織指標的影響Table5 Effect of ethyl acetate phase on skin tissue parameters in mice

3 結論

本實驗通過各萃取相對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基、總還原力的四種抗氧化實驗說明了迎春花各萃取相均有較好的抗氧化能力,并對其各萃取相進行了總黃酮含量的測定,發現黃酮含量越高,抗氧化能力越強,其中乙酸乙酯相總黃酮含量最高,達到6%,其抗氧化能力也最好。在抗氧化實驗中,乙酸乙酯相抗氧化能力最強,乙酸乙酯相、氯仿相和總提取物在清除DPPH自由基時清除率均達到98%以上,達到抗氧化劑水平,在羥基自由基、超氧陰離子自由基、總還原力實驗中乙酸乙酯相也是各萃取相中抗氧化能力最好的,氯仿相和正丁醇相也對其具有較強的抗氧化能力,并隨著濃度的增長,抗氧化能力逐漸增強。因此選擇乙酸乙酯相進行小鼠體內實驗。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)是人體內重要的抗氧化酶,提高它的活性可以增強機體免疫功能,丙二醛(MDA)是脂質過氧化的終產物,MDA含量的高低間接反映細胞衰老程度。在小鼠體內抗衰老實驗中,乙酸乙酯相可提高小鼠血清和皮膚組織中SOD、CAT、POD和GSH活性,并且隨著給藥濃度的增加,效果逐漸增強,與模型對照組差異性顯著(p<0.05,p<0.01);而在小鼠血清中MDA和小鼠皮膚組織MDA、Hyp含量,隨著給藥濃度的增加,其值逐漸降低,實驗表明,乙酸乙酯相具有較好的抗氧化作用。本實驗研究為開發迎春花抗氧化保健品的研究提供了理論依據。

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Biological activity of total flavonoid fromJasminumnudoiflorumLindl

HOU Bei1,ZHAO Cheng-ai1,*,HAN Lu1,MA Bing-yang1,XU Wei-qiang1,LU Ze2

(1.College of Resources and Environment,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China；2.College of Science,Yanbian University,Yanji 133002,China)

Objective:The antioxidant activity of total flavonoid of each extraction phase separated fromJasminumnudoiflorumLindlwas studied. Methods:The antioxidant activity was investigated through testing the scavenging activity and reducing power of total flavonoid to DPPH radicals,hydroxyl radicals and superoxide anion radical. The extraction phase with the best antioxidant activity was selected to do the anti-aging experiments to the mice induced byD-galactose,including testing the value of MDA,SOD,CAT,POD,GSH,Hyp. Results:Each of the extraction phase separated formJasminumnudoiflorumLindlhad a high scavenging activity and total reducing power to the DPPH radicals,hydroxyl radicals and superoxide anion radical. The scavenging activity of ethyl acetate phase could reach to 98%. In the anti-aging experiments to the mice,ethyl acetate phase could greatly enhance the activity of SOD,CAT,POD and GSH to the ageing mice and reduce the quantity of MDA,Hyp. Conclusion:Throughinvitroantioxidant experiments,ethyl acetate phase separated fromJasminumnudoiflorumLindlhad the strongest oxidative capacity. Theinvivoexperiment to the ageing mice further determined the strong anti-aging ability of ethyl acetate phase.

JasminumnudoiflorumLindl;flavonoids;antioxidant activity;anti-aging

2014-07-22

侯蓓(1989-)，女，在讀碩士，研究方向：天然產物化學。

*通訊作者:趙成愛(1964-)，女，碩士，教授，主要從事天然產物化學研究。

吉林省科技發展計劃項目(20120907)。

TS201.1

A

:1002-0306(2015)09-0353-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.09.069