rhKD/APPvar對實驗性急性肝損傷小鼠肝細胞增殖能力的影響

王虹蛟，孟威宏，王 強*，王心童，顏煒群，任立群

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·論著·

rhKD/APPvar對實驗性急性肝損傷小鼠肝細胞增殖能力的影響

王虹蛟1，孟威宏2，王 強1*，王心童3，顏煒群4，任立群4

目的 探討重組人淀粉樣蛋白前體Kunitz型蛋白酶抑制劑結構域變異體(Reorganization human Kunitz protease inhibitor domain of amyloid protein precursor variant，rhKD/APPvar)對實驗性急性肝損傷小鼠肝細胞增殖能力的影響。方法利用實驗鼠的四氯化碳(CCl4)慢性肝損傷模型，采用免疫組化方法，檢測各組增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)陽性細胞數。結果正常對照組的PCNA陽性細胞數為(2±2)個/視野，模型組的PCNA陽性細胞數為(6±3)個/視野，rhKD/APPvar小、中、大劑量組的PCNA陽性細胞個數分別為(29±110)個/視野、(38±10)個/視野、(55±12)個/視野，抑肽酶組的PCNA陽性細胞個數為(24±9)個/視野，rhKD/APP組的PCNA陽性細胞個數為(19±5)個/視野。與模型組相比，rhKD/APPvar各劑量組PCNA陽性細胞數目均顯著增加(P<0.05)，并且存在劑量依賴關系。rhKD/APPvar各劑量組陽性細胞數多于抑肽酶組。結論rhKD/APPvar能夠促進急性肝損傷小鼠肝細胞增殖，其作用隨著劑量的增加而增強。

rhKD/APPvar；四氯化碳；急性肝損傷；小鼠；免疫組織化學

0 引言

肝損傷防治研究是國內外研究的熱點[1-6]。本文首先利用昆明小鼠建立四氯化碳(CCl4)肝損傷模型，然后用重組人淀粉樣蛋白前體中的Kunitz型蛋白酶抑制劑結構域變異體(Reorganization human KD/APP variant，rhKD/APPvar)進行治療，通過免疫組織化學染色法觀察各組小鼠肝細胞的增殖能力，探討rhKD/APPvar對急性肝損傷小鼠肝細胞增殖能力的影響，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 70只健康昆明種小鼠，6～8周齡，雌雄各半，體重20～23 g。購自長春高新醫學動物研究中心(動物許可證：醫動字第1055113)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠急性CCl4肝損傷模型的建立 將CCl4溶解于市售精制花生油中，配制濃度為0.1%(V/V)的CCl4油溶液。正常對照組按20 mL/kg劑量腹腔注射花生油，其他各組小鼠按20 mL/kg劑量腹腔注射0.1% CCl4油溶液。禁食不禁水。

1.2.2 動物分組及給藥 昆明種小鼠隨機分為7組：正常對照組(空白組)、CCl4中毒模型組(模型組)、rhKD/APPvar小、中、大劑量組及抑肽酶組、rhKD/APP組，每組10只。空白組和模型組腹腔注射等量生理鹽水；rhKD/APPvar小、中、大劑量組每天分別腹腔注射2、4、8萬KIU/kg的rhKD/APPvar,給藥7 d；抑肽酶組每天腹腔注射4萬KIU/kg抑肽酶，給藥7 d；rhKD/APP組每天腹腔注射4萬KIU/kg的rhKD/APP，給藥7 d。末次給藥1 h后，腹主動脈取血，檢測血清中ALT、AST水平。

1.2.3 免疫組織化學染色 末次給藥1 h后，處死小鼠，取肝大葉相同部位的肝組織,在10%福爾馬林中固定，按常規方法制作組織切片。①脫蠟與修復：石蠟切片進行常規脫蠟(二甲苯洗2次，每次30 min；無水乙醇洗2次，每次10 min；95%乙醇洗2次，每次5 min；80%乙醇洗1次，5 min)，蒸餾水洗2次之后，將切片置于枸櫞酸鹽修復液中，98 ℃加熱修復；②待切片冷卻至40 ℃以下之后，滴加3% H2O2，以滅活內源性過氧化物酶活性，室溫孵育15 min之后，用PBS沖洗3次，每次5 min；③利用兔血清封閉，室溫孵育30 min，甩去多余血清；④滴加兔抗人PCNA抗體(1∶100稀釋)，4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次5 min；⑤滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；⑥滴加三抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；⑦滴加DAB顯色1 min，用自來水中止發色；⑧蘇木素復染5 min，弱氨水返藍10 s，自來水沖洗；⑨脫水、透明及封片：80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ及100%乙醇Ⅱ脫水各5 min；二甲苯透明2次，每次5 min；樹膠封片。

1.3 判定標準 在200倍顯微鏡下，每張切片選取5個不同視野，計數每個視野中的增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)陽性細胞數。

2 結果

2.1 PCNA陽性細胞數結果 空白組的PCNA陽性細胞數為(2±2)個/視野，模型組PCNA陽性細胞數為(6±3)個/視野；rhKD/APPvar小、中、大劑量組的PCNA陽性細胞個數分別為(29±11)個/視野、(38±10)個/視野、(55±12)個/視野；抑肽酶組PCNA陽性細胞個數為(24±9)個/視野；rhKD/APP組PCNA陽性細胞個數為(19±5)個/視野。rhKD/APPvar各劑量組的PCNA陽性細胞數目均顯著高于模型組(P<0.05)；rhKD/APPvar劑量越大，PCNA陽性細胞數目越多。提示rhKD/APPvar能夠促進肝細胞增殖，并存在劑量依賴關系。rhKD/APPvar各劑量組PCNA陽性細胞數也多于抑肽酶組。

2.2 形態學結果 PCNA免疫組織化學染色結果顯示，rhKD/APPvar各劑量組肝組織中的PCNA陽性細胞增殖均較為活躍，其以rhKD/APPvar大劑量組的PCNA陽性細胞增殖最為活躍(圖1)。

圖1 肝細胞PCNA陽性細胞增殖形態(×200)

3 討論

目前國內外多采用CCl4建立肝損傷模型[7-10]。CCl4主要經呼吸道和消化道進入體內，導致肝臟損傷，這可能與CCl4自身和其自由基代謝產物有關。CCl4進入體內后，生成代謝產物三氯甲基自由基(CCl3·)和氯自由基(Cl·)。CCl3·能夠與細胞膜的不飽和脂肪酸發生反應，生成脂肪酸，引起膜的脂質過氧化，導致膜結構和功能受到破壞，最終導致肝細胞發生壞死[11]。CCl3·還抑制細胞膜和微粒體膜上鈣泵的活性，導致Ca2+離子內流增加，最終引起細胞壞死。在缺氧條件下，CCl3·能引起多不飽和脂肪酸過氧化而導致肝細胞破裂。Samar等[12]發現CCl4引起的肝損害是通過自由基所誘導的脂質過氧化反應產生的，自由基和環氧合酶介導的花生四烯酸產物的氧化與實驗性的肝毒性密切相關。

增殖細胞核抗原(PCNA)只表達于正常的增殖細胞以及腫瘤細胞中，在細胞增殖的啟動過程中具有重要作用，因此，PCNA是反映細胞增殖狀態的重要指標。本文通過檢測實驗鼠肝組織中PCNA陽性細胞的數量，來評價急性肝損傷小鼠肝細胞的增殖能力。

淀粉樣蛋白前體中的Kunitz型蛋白酶抑制劑結構域(KD/APP)是人Kunitz型蛋白酶抑制劑，具有強烈抑制絲氨酸蛋白酶的活性。本研究利用肝損傷的動物模型，探討rhKD/APPvar對急性肝損傷小鼠肝細胞增殖能力的影響。利用免疫組織化學技術，檢測各實驗組肝細胞的PCNA表達水平，從而評價各組肝細胞的增殖情況。結果顯示，rhKD/APPvar各劑量組的PCNA陽性細胞數均多于模型組，隨著rhKD/APPvar劑量的增加，PCNA陽性細胞數目也增加。說明rhKD/APPvar能夠促進急性肝損傷肝細胞增殖，并存在劑量依賴關系。rhKD/APPvar各劑量組PCNA陽性細胞數多于抑肽酶組和rhKD/APP組。

實驗結果表明，rhKD/APPvar可以促進PCNA陽性細胞的增殖，減輕急性肝損傷的程度，對小鼠急性CCl4肝損傷模型具有較好的保護性作用，為急性肝損傷的保護及治療提供了實驗依據。

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Effect of rhKD/APPvar on hepatocyte proliferation ability in mice with acute liver injury

WANG Hong-jiao1,MENG Wei-hong2,WANG Qiang1*,WANG Xin-tong3,YAN Wei-qun4,REN Li-qun4

(1.The 461 Hospital of PLA,Changchun 130021,China; 2.The General Hospital of Shenyang Military District,Shenyang 110016,China; 3.China-Japan Union Hospital,Jilin University,Jilin 130033,China; 4.The Institute of Frontier Medical Science,Jilin University,Jilin 130021,China)

Objective To study the effect of reorganization human Kunitz protease inhibitor domain of amyloid protein precursor variant (rhKD/APPvar) on hepatocyte proliferation ability in mice with experimental acute liver injury and provide theoretical basis for study on protective effect of rhKD/APPvar on acute liver injury.MethodsThe acute hepatic injury model of rats were induced by carbon tetrachloride (CCl4).Immunohistochemical method was used to observe the proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-positive cell number in various groups.ResultsThe positive cell number in control group was (2±2)/vision; (6±3)/vision in model group; (29±11)/vision,(38±10)/vision and (55±12)/vision in low,middle,and high dose rhKD/APPvar groups; (24±9)/vision in aprotinin group,(19±5) /vision in rhKD/APP group.The positive cell numbers in rhKD/APPvar group markely increased compared with model group(P<0.05),the positive cell number increased with the increase of rhKD/APPvar.The positive cell numbers in rhKD/APPvar groups were more than those in aprotinin group.ConclusionThe rhKD/APPvar could promote the proliferation of acute injured liver cells and the effect could be enhanced by titrating of rhKD/APPvar.

rhKD/APPvar; Carbon tetrachloride; Acute hepatic injury; Mice; Immunohistochemistry

2014-12-25

1.長春解放軍第461醫院，長春 130021；2.沈陽軍區總醫院，沈陽 110016；3.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 130033；4.吉林大學再生醫學科學研究所，吉林 130021

國家自然基金課題(30300153)

10.14053/j.cnki.ppcr.201505001

*通信作者