RT-PCR檢測非小細胞肺癌前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的臨床研究

陳曹陽　李　軍　陳　濤　周鴻敏

皮　勇1　王忠明1　陳　燕1

RT-PCR檢測非小細胞肺癌前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的臨床研究

陳曹陽1李軍2陳濤2周鴻敏2

皮勇1王忠明1陳燕1

隨著環(huán)境污染的加重和吸煙率的增加，肺癌已經(jīng)成為我國居民首位死亡原因，占所有惡性腫瘤死亡的22.7%[1-3]。雖然外科技術(shù)水平不斷提高，術(shù)后輔助放化療、基因治療等治療手段不斷成熟，肺癌的近期治療效果較以前有了很大改善，但非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的遠期預(yù)后卻仍不盡人意。Ⅰ期(pN0)NSCLC行根治術(shù)后5年生存率僅60%～70%[4-5]，而術(shù)后兩年腫瘤復(fù)發(fā)率則達30%[6-7]。

研究顯示腫瘤復(fù)發(fā)與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移未被檢出有關(guān)[8-11]，微轉(zhuǎn)移是指存在于外周血、淋巴道、骨髓等組織器官中，但尚未形成轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)，用常規(guī)影像診斷方法難以發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)移腫瘤細胞[12]。如果能提高淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢出率，精確TNM分期，就能更加準確的制定下一步治療方案，從而減少腫瘤復(fù)發(fā)，延長患者的生存時間。研究報道前哨淋巴結(jié)定位活檢(sentinel lymph node mapping and biopsy, SLNB)聯(lián)合分子生物學(xué)檢測技術(shù)可提高淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢出率[13-14]。

本研究應(yīng)用RT-PCR檢測CK19mRNA在NSCLC前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node, SLN)中的表達，探討RT-PCR檢測技術(shù)在NSCLC SLN微轉(zhuǎn)移診斷中的可行性及其臨床意義。

材料與方法

一、一般資料

收集2010年6月至2011年6月華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院學(xué)院附屬同濟醫(yī)院心胸外科收治的24例Ⅰ期(cT1N0M0/cT2N0M0)肺癌患者手術(shù)中取得所有淋巴結(jié)標本，其中男16例，女8例，平均年齡56.4(41～62)歲。所有病例均符合下列條件：系原發(fā)腫瘤，無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；腫瘤距隆突≥2 cm；頭部CT、腹部B超、骨ECT等檢查無腫瘤遠處轉(zhuǎn)移，肺功能、心電圖、血尿常規(guī)、肝腎功能等評估可行肺葉切除術(shù)；術(shù)前未行放化療。

二、研究方法

1. 標本采集：所有病例術(shù)中行SLNB，即探查病變情況確定可以手術(shù)切除后將4 ml亞甲藍注射于腫瘤周圍(前、后、左、右各1 ml)。3～5 min后觀察肺門及縱隔淋巴結(jié)有無藍染，有藍染者為SLN。然后行肺葉切除術(shù)及根據(jù)淋巴結(jié)藍染情況行淋巴結(jié)清掃術(shù)。所有淋巴結(jié)取出后用無菌生理鹽水清洗去除周圍脂肪組織，然后各枚淋巴結(jié)均分為兩半，一半送常規(guī)病理檢查，明確腫瘤病理類型、分化程度及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；另一半編號置于-80℃冰箱保存用于CK19mRNA檢測。

參照美國Louisville大學(xué)SLNB評價標準[15]。SLN陽性：SLN有轉(zhuǎn)移；SLN陰性：SLN及NSLN均無轉(zhuǎn)移；假陰性：NSLN有轉(zhuǎn)移，而SLN無轉(zhuǎn)移；敏感性計算方法：敏感性=(SLN陽性病例數(shù)/肺門縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例數(shù))；準確率計算方法：準確率=[(SLN陽性病例數(shù)+SLN陰性病例數(shù))/SLN活檢總例數(shù)]×100%；假陰性率計算方法：假陰性率=(假陰性病例數(shù)/肺門縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例數(shù))×100%。

2. RT-PCR檢測CK19mRNA在NSCLC SLN中的表達：將置于-80 ℃冰箱保存的淋巴結(jié)(SLN67枚，NSLN79枚)行淋巴結(jié)總RNA的提取(TRIzol法)；提取的總RNA行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen公司，Oligo(dT)18、dNTP、5x buffer、DTT、RNase inhibitor、M-MLV等購于武漢谷歌生物科技有限公司)獲得cDNA；RT-PCR反應(yīng)獲得DNA樣品，CK19上、下游引物購于日本TOYOBO公司(CK19：5’-TCCGAACCAAGTTTGAGACG-3’和5’-ATTGGCTTCGCATGTCACTC-3’)，actin上、下游引物由上海生工合成(actin： 5’-GTCCACCGCAAAT

GCTTCTA-3’和5’-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3’)，擴增引物在瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結(jié)果經(jīng)過成像并圖像分析。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

所有資料輸入計算機，采用SPSS10.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用卡方檢驗，若P值小于0.05，則兩樣本率的比較有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

術(shù)后經(jīng)病理證實24例患者中鱗癌15例，腺癌9例。術(shù)中取得淋巴結(jié)總共146枚，平均6～8枚，其中SLN 67枚，NSLN 79枚。67枚SLN中，21枚RT-PCR檢測顯示CK19(+)(圖1，2)，陽性率為31.3%(21/67)， 3枚常規(guī)病理HE染色顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(圖3，4)，陽性率為4.5%(3/67)，統(tǒng)計學(xué)分析P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。24例SLN經(jīng)過RT-PCR檢測后確定病理分期13例N0，9例N1，2例N2。術(shù)中SLN主要分布于葉間、肺門、支氣管旁等位置。79枚NSLN中，常規(guī)病理HE染色及RT-PCR均未檢出微轉(zhuǎn)移。參照SLNB評價標準，SLN敏感性為100%，準確率為91.7%(22/24)，假陰性率為0%。

圖1　CK19與actin擴增產(chǎn)物鑒定

圖2　SLN中CK19(+)擴增產(chǎn)物鑒定

圖3　SLN無轉(zhuǎn)移(HE ×200)

圖4　SLN轉(zhuǎn)移(HE ×200)

討論

本研究應(yīng)用RT-PCR檢測CK19mRNA在24例cT1N0M0/ cT2N0M0 NSCLC SLN中的表達，與常規(guī)病理HE染色結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示RT-PCR較HE染色微轉(zhuǎn)移檢出率要高，證明了RT-PCR在NSCLC SLN微轉(zhuǎn)移診斷中的可行性。而且本研究中有9例患者的病理分期改變，其中13例N0，9例N1，2例N2，比常規(guī)病理HE染色TNM分期要準確。另外，參照SLNB評價標準，SLN敏感性為100%，準確率為91.7%(22/24)，假陰性率為0%。在NSLN中常規(guī)病理HE染色及RT-PCR均未檢出微轉(zhuǎn)移，進一步證實了SLN的準確性以及SLNB在NSCLC中應(yīng)用的可行性。

SLNB不僅可以解決外科醫(yī)生在NSCLC淋巴結(jié)清掃中所遇到的困擾，同時可以減輕病理科醫(yī)生切片檢查的工作量。另外，如果應(yīng)用RT-PCR或其他更加敏感而簡單的方法檢測SLN中的微轉(zhuǎn)移，就可以大大提高NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢出率，從而精確腫瘤TNM分期，通過輔助治療來提高NSCLC患者的生存率。

本研究所遇到的問題包括：(1)亞甲藍外漏可能污染手術(shù)視野，對SLNB造成一定困難；(2)縱隔及肺門淋巴結(jié)因黑色物質(zhì)沉著導(dǎo)致不能辨認淋巴結(jié)是否藍染，造成SLN假陰性或假陽性；(3)癌栓堵塞回流淋巴管，導(dǎo)致下一站淋巴結(jié)無法示蹤，可能造成SLN假陰性；(4)腫瘤跳躍性轉(zhuǎn)移會造成SLN假陰性；(5)本研究雖然在NSLN中未檢測出微轉(zhuǎn)移的存在，但是不排除與樣本量大小有關(guān)等原因所導(dǎo)致的微轉(zhuǎn)移漏檢的存在。

因此，下一步研究方向包括提高SLN定位的準確性、繪制NSCLC的SLN常見轉(zhuǎn)移區(qū)域圖、確定具有NSCLC腫瘤特異性的分子檢測標志物、統(tǒng)一標準的微轉(zhuǎn)移檢測方法、掌握NSCLC SLN微轉(zhuǎn)移檢測與長期生存率有關(guān)的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)等。相信隨著上述問題的解決，SLNB終將會取代NSCLC傳統(tǒng)淋巴清掃術(shù)。

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(本文編輯：黃紅稷)

陳曹陽，李軍，陳濤，等. RT-PCR檢測非小細胞肺癌前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的臨床研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2015， 8(4)： 436-439.

·論著·

【摘要】目的探討RT-PCR在非小細胞肺癌(NSCLC)前哨淋巴結(jié)(SLN)微轉(zhuǎn)移診斷中的可行性及其臨床意義。方法選擇24例cT1N0M0/cT2N0M0 NSCLC患者在術(shù)中行SLN定位活檢，應(yīng)用RT-PCR檢測SLN中CK19mRNA的表達來判斷微轉(zhuǎn)移的存在，與常規(guī)病理HE染色結(jié)果進行比較，并結(jié)合臨床進行分析。結(jié)果24例cT1N0M0/cT2N0M0 NSCLC患者(鱗癌15例，腺癌9例)，術(shù)中共取得淋巴結(jié)146枚，平均6～8枚/例。其中SLN 67枚，非SLN 79枚，SLN敏感性為100%，準確率為91.7%(22/24)，假陰性率為0%。SLN中常規(guī)病理HE染色檢出3枚轉(zhuǎn)移(陽性率為4.5%，3/67)，RT-PCR檢測SLN中21枚CK19陽性(陽性率為31.3%，21/67)，顯著高于常規(guī)病理HE染色對SLN微轉(zhuǎn)移檢出陽性率(4.5%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。79枚非SLN中，常規(guī)病理HE染色及RT-PCR均未檢出微轉(zhuǎn)移。結(jié)論RT-PCR應(yīng)用于檢測NSCLC SLN微轉(zhuǎn)移的診斷是可行的，聯(lián)合應(yīng)用SLN定位活檢，可明顯提高NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢出率。此方法可精確NSCLC TNM分期，指導(dǎo)術(shù)后輔助治療，有望提高Ⅰ期NSCLC的生存率。

【關(guān)鍵詞】非小細胞肺癌；前哨淋巴結(jié)；微轉(zhuǎn)移；細胞角蛋白；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

Detection of micrometastasis of sentinel lymph node in non-small cell lung cancer by RT-PCR and its clinical significanceChenCaoyang1,LiJun2,ChenTao2,ZhouHongmin2,PiYong1,WangZhongming1,ChenYan1.1CardiothoracicandVascularDepartmentofZhongshanHospitalAffiliatedtoWuhanUniversity,Wuhan430033China;2CardiovascularDepartmentofTongjiHospitalAffiliatedtoHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430000China

Correspondingauthor：LiJun,Email: 910747447@qq.com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the feasibility and clinical significance of RT-PCR in diagnosis of micrometastasis of sentinel lymph node(SLN) in non-small cell lung cancer(NSCLC). MethodsA total of 24 cT1N0M0/cT2N0M0 NSCLC patients were intraoperatively using sentinel lymph node biopsy, for detecting the presence of micrometastasis, RT-PCR was applied to detect the expression of CK19mRNA in SLN, pathological and clinical analysis was compared with the conventional HE staining results. ResultsIn 24 cT1N0M0/cT2N0M0 NSCLC cases (15 squamous cell carcinoma cases, 9 adenocarcinoma cases), intraoperatively obtained 146 lymph nodes(average 6 to 8), including 67 SLN and 79 non-sentinel lymph nodes. SLN sensitivity was 100%, accuracy was 91.7%, and false negative rate was 0%. 3 sentinel lymph nodes were detected micrometastasis by conventional pathological HE staining (positive rate 4.5%, 3/67), 21 sentinel lymph nodes CK19-positive by RT-PCR (positive rate 31.3%, 21/67). RT-PCR for detection of positive sentinel lymph node micrometastasis was 31.3%, significantly higher than conventional pathological HE staining positive rate 4.5%, the difference was statistically significant (P<0.05). Metastasis wasn′t detected in 79 non-sentinel lymph nodes. ConclusionsCombined sentinel lymph node biopsy and RT-PCR technique can significantly improve the NSCLC detection rate of lymph node micrometastasis. This method can be accurate TNM staging NSCLC and guide adjuvant therapy to improve stageⅠ NSCLC survival.

【Key words】Non-small cell lung cancer;Sentinel lymph node;Micrometastasis;Cytokeratin;Reverse-transcriptase polymerase chain reaction

收稿日期：(2015-04-27)

文獻標識碼：中圖法分類號： R473.2 A

通訊作者：李軍，Email: 910747447@qq.com

DOI：作者單位： 430033 武漢，武漢大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸心血管外科1;430000 武漢，華中科技大學(xué)附屬同濟醫(yī)院心臟大血管外科2