丹皮酚對脂多糖誘導的大鼠血管內皮細胞VCAM-1、TNF-α釋放及TLR4/NF-κB信號通路的影響

楊　黎， 戴　敏， 陳　鵬

(安徽中醫藥大學藥學院　省部共建新安醫學教育部重點實驗室，安徽 合肥　230012)

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丹皮酚對脂多糖誘導的大鼠血管內皮細胞VCAM-1、TNF-α釋放及TLR4/NF-κB信號通路的影響

楊黎， 戴敏， 陳鵬

(安徽中醫藥大學藥學院省部共建新安醫學教育部重點實驗室，安徽 合肥230012)

[摘要]目的觀察丹皮酚(Paeonol，Pae)對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的大鼠血管內皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)釋放血管內皮細胞黏附因子-1(vascular endothelial cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及Toll樣受體-4(toll-like receptor，TLR4)/核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路的影響，以闡明Pae抑制VECs黏附功能的分子機制。方法組織塊預消化貼壁法分離培養VECs，采用LPS誘導VECs炎性損傷；健康大鼠灌胃給予Pae制備含藥血清，反相高效液相色譜法測定血清Pae的含量；RT-PCR法檢測TLR4 mRNA的表達；凝膠遷移試驗檢測NF-κB蛋白的表達；免疫組織化學檢測VCAM-1的表達；放射免疫法檢測TNF-α的表達。結果Pae含藥血清(2.5，5，10 μg/mL)作用于LPS誘導的VECs 24 h，可抑制VECs中TLR4 mRNA和NF-κB蛋白表達，以及VCAM-1和TNF-α分泌，呈現一定的劑量依賴性，其中Pae 10 μg/mL的抑制作用均具有統計學意義(P<0.05)。結論Pae降低TNF-α的釋放和VCAM-1水平，可能是通過下調LPS誘導的TLR4/NF-κB信號通路的活化而實現的。

[關鍵詞]丹皮酚；血管內皮細胞；脂多糖；TLR4/NF-κB信號通路；VCAM-1；TNF-α

炎性反應貫穿于動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發生發展的全過程[1-2]，血管內皮細胞(vascular endothelial cells，VECs)因炎性損傷而引起與單核細胞的黏附在其中扮演著重要的角色[3-4]。微生物感染作為AS的一種誘發因素受到了越來越多的重視，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌外膜成分之一，是一種強烈的炎癥啟動因子，能與血漿中LPS結合蛋白結合成復合物，運載至靶細胞，與靶細胞膜上的跨膜受體Toll樣受體4(toll-like receptor，TLR4)結合，繼而活化核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB),可導致一系列細胞因子和黏附分子的釋放，引起VECs的炎性損傷并促進與單核細胞的黏附，引發AS的病理生理改變[5]。

丹皮酚(Paeonol，Pae)是毛茛科植物牡丹PaeoniaSuffruticoasAndr.的干燥根皮及蘿摩科植物徐長卿Cynanchumpaniculatum(Bge.)Kitag.的干燥根及根莖中的有效成分之一。本課題組前期研究[6]發現，Pae含藥血清具有顯著抗炎作用及抑制VECs的黏附功能，然而Pae對LPS誘導的黏附功能改變是否與對TLR4的表達有關？從而影響了LPS誘導VECs的NF-κB信號通路？調控腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的內源性釋放和黏附分子的表達？通過對以上問題的分析有助于進一步確認Pae對LPS誘導的VECs炎性反應的調節位點，為Pae抗AS作用的炎癥機制提供依據。

1材料

1.1實驗動物健康Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級，雄性，體質量(160±10)g，安徽醫科大學動物實驗中心提供，生產許可證號：SCXK(皖)2011-0015。

1.2藥物及試劑Pae：安徽省宣城百草植物工貿有限公司，純度99%，批號 050321，用β-環糊精(中國醫藥集團上海試劑公司)包合為Pae β-環糊精包合物，用0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)配制成混懸液灌胃用；特級胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)：天津市灝洋生物制品科技責任有限公司，批號 080705c199；LPS：美國Sigma公司，批號 080214；肝素鈉：江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，批號 0802114；核蛋白提取試劑盒、凝膠遷移試驗(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)試劑盒、超敏感底物發光試劑盒：美國Pierce公司；鏈霉親合素-過氧化酶(streptavidin peroxidase, SP)免疫組織化學試劑盒、二氨基聯苯胺(diaminobenzidine， DAB)顯色試劑盒：北京中杉生物技術有限公司；TNF-α放射免疫分析試劑盒：北京普爾偉業生物科技有限公司；血管內皮細胞黏附因子-1(vascular endothelial cell adhesion molecule-1，VCAM-1)單克隆抗體：武漢博士德生物工程有限公司；乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Tween-20、乙酸、鹽酸和甲醇均為分析純：上海試劑一廠和上海試劑四廠。

1.3主要儀器CO2培養箱：日本Sanyo公司；潔凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；Hoefer電泳儀：Amersham Biosciences公司；PCR儀：Biometra TGRADIENT公司；低溫高速離心機：德國EPPENDORF公司；凝膠成像系統：意大利Bio-Rad公司；DYY-10 ECP 3000電泳儀：北京六一儀器廠；EL301 strip reader：美國Bio-Tek公司；GSM凝膠圖像分析管理系統：黑馬儀器公司。

2方法

2.1Pae含藥血清的制備[7-8]SD大鼠6只，隨機分成空白血清組3只與Pae β-環糊精包合物給藥組(400 mg/kg)3只。灌胃給藥，每日2次，連續3 d，空白組給予相同容積的溶劑(0.5% CMC-Na)。末次給藥后30 min(末次給藥前禁食不禁水12 h)，采用3.5%水合氯醛麻醉，從腹主動脈取血。室溫靜置2 h，3 500 r/min離心10 min，無菌條件下分離血清，同種條件血清混勻，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后分裝，-20 ℃避光保存備用。RP-HPLC測定含藥血清中Pae含量。方法參見課題組前期研究[5]進行。

2.2大鼠主動脈VECs的分離、培養與鑒定

2.2.1鼠尾膠原的制備及培養瓶包被取大鼠1只，全尾剪下并置于75%乙醇溶液中浸泡30 min，無菌條件下抽出尾腱，滅菌三蒸水洗3次，剪碎尾腱，放入100 mL 0.1%乙酸溶液中，置4 ℃冰箱中，不時搖晃，48 h后無菌條件下移入滅菌離心管中，4 000 r/min離心30 min，吸取無色透明膠狀上清液，分裝，-20 ℃冷凍保存。取培養瓶，無菌條件下加入鼠尾膠原溶液2 mL使其覆蓋于培養瓶底部，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養1 h，吸棄多余液體，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)輕洗3次，再用2 mL含有20% FBS和105U/L肝素鈉的達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM)漂洗1次即可。

2.2.2大鼠主動脈VECs的分離、培養與鑒定[9]大鼠頸椎脫臼處死，無菌條件下取出胸主動脈，剝離干凈血管外結締組織及脂肪組織，外翻血管，暴露內膜，用滅菌線扎緊血管兩端，放入裝有0.2% Ⅰ型膠原酶的離心管中，37 ℃、5% CO2消化培養1 h，含20% FBS的DMEM漂洗2次，剪去封口的兩端，余下主動脈血管剪成約2 mm×2 mm小塊，內膜朝下貼入鼠尾膠原包被的培養瓶中，并加入1 mL含20% FBS的DMEM，37 ℃、5% CO2培養。當原代細胞爬出并生長融合形成致密的單層細胞時即可傳代。免疫細胞化學SP法鑒定血管內皮細胞。

2.3LPS誘導大鼠VECs損傷模型分組取3～5代VECs接種于6孔板中，待其融合至80%左右，換入含0.5% FBS的培養液同步化24 h，繼而加入含不同濃度(2.5、5、10 μg/mL)Pae含藥血清的培養液(20% FBS)培養24 h。另設空白組和單加LPS組，相同處理。

2.4RT-PCR檢測TLR4 mRNA表達將VECs經“2.3”項分組處理后，再加入LPS(終濃度為10 ng/mL)培養5 h后，除去舊培養基，用PBS漂洗后，加入TRIzol試劑完全裂解細胞，收集細胞裂解液至無RNA酶的EP管中，用氯仿抽提，異丙醇沉淀，離心靜置，回收總RNA于-80 ℃儲存備用。紫外分光光度計鑒定濃度和純度(測定A260/A280比值)。cDNA合成條件：50 ℃下30 min，99 ℃下5 min，-20 ℃保存備用。TLR4引物序列(508 bp)：上游為5′-TGGATACGTTTCCTTATAAG-3′，下游為5′-GAAATGGAGGCACCCCTTC-3′；內參β-actin引物序列(318 bp)：上游為5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′，下游為5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統下觀察分析。

2.5ESMA檢測NF-κB的表達將VECs經“2.3”項分組處理后，再加入LPS(終濃度為10 ng/mL)培養1 h后，除去舊培養基，PBS漂洗3次，按核蛋白抽提試劑說明書抽提核蛋白，抽提后的核蛋白保存在-80 ℃下備用。Lowry法蛋白定量后，將蛋白質濃度調整為一致。利用EMSA法進行NF-κB的檢測，并通過GSM凝膠圖像分析管理系統分析結果。

2.6免疫組化檢測VCAM-1的表達將洗凈滅菌的蓋玻片置于6孔板中，調整細胞數為1×105/mL，加入含不同濃度(2.5，5，10 μg/mL)Pae含藥血清的培養液培養24 h，再加入LPS(終濃度為10 ng/mL)繼續培養5 h，另設空白組和單加LPS組，相同處理。免疫組織化學鑒定VECs胞漿內VCAM-1的表達，對照組用PBS代替一抗。結果判定：以細胞核呈黃色或棕黃色者為VCAM-1表達陽性細胞，在100倍鏡下隨機選取10個視野，分別計算每個視野VCAM-1表達陽性細胞百分率(I)并予賦值：0表示無陽性或非常弱陽性，1表示I<25%，2表示25%≤I<50%，3表示50%≤I<75%，4表示75%≤I<100%，以10個視野的平均賦值作為該樣本的檢測值。

2.7放射免疫法檢測血清TNF-α的含量將VECs經“2.3”項分組處理后，再加入LPS(終濃度為10 ng/mL)培養5 h后，吸取細胞上清液，按照放射免疫法試劑盒說明書操作，定量檢測細胞上清液中TNF-α。用TNF-α抗血清及125I-TNF-α加在一起進行競爭性結合反應，采用自動放射免疫儀測定并計算TNF-α濃度。

3結果

3.1大鼠血清中Pae的含量本實驗所用含藥血清與課題組前期所用含藥血清為同一批次，參見課題組前期研究[6]方法測得血清中Pae含量10.37 mg/L。

3.2VECs形態學觀察及鑒定原代培養的VECs呈多角形單層鋪路石樣，排列緊密，細胞邊緣光滑，胞核清晰(見圖1A)。免疫細胞化學SP法檢查Ⅷ因子相關抗原，鏡下細胞胞漿呈棕黃色，即呈陽性反應，證明所培養細胞為內皮細胞(見圖1B)。

圖1VECs原代形態學觀察及免疫組化鑒定結果

3.3Pae對LPS誘導的VECs表達TLR4 mRNA的影響LPS顯著上調了VECs中TLR4 mRNA的表達(P<0.05)；Pae作用VECs后，下調了由LPS誘導的TLR4 mRNA表達水平，尤以10 μg/mL Pae組作用最為顯著(P<0.05)。見圖2、圖3。

3.4Pae對LPS誘導的VECs表達NF-κB的影響LPS顯著上調VECs中NF-κB的表達水平(P<0.05)；Pae作用VECs后，下調了由LPS誘導的NF-κB表達水平，尤以10 μg/mL Pae組的作用最為顯著(P<0.05)。見圖4、圖5。

注:M：Marker；1.空白組；2. 10 ng/mL LPS組；3. LPS+2.5 μg/mL Pae組；4. LPS+5 μg/mL Pae組；5. LPS+10 μg/mL Pae組。

圖2Pae對LPS誘導的VECs

表達TLR4 mRNA的影響(RT-PCR法)

注:含有相同右上標符號的組別相比較，P>0.05；不含相同右上標符號的組別相比較，P<0.05。

圖3Pae對LPS誘導的VECs

表達TLR4 mRNA的影響(n=5)

注：1. 空白組；2. 10 ng/mL LPS組；3. LPS+2.5 μg/mL Pae組；4. LPS+5 μg/mL Pae組；5. LPS+10 μg/mL Pae組。

圖4Pae對LPS誘導的VECs

表達NF-κB的影響(EMSA法)

3.5Pae對LPS誘導的VECs表達VCAM-1的影響經DAB免疫組織化學染色，可見陽性細胞胞核呈淡棕色、細胞核內有棕黃色顆粒，VCAM-1陽性率隨Pae含藥血清濃度的升高而下降，而且核染色呈棕黃色的細胞數也明顯減少。表明LPS可以使VECs表達VCAM-1的陽性細胞數增加，而Pae含藥血清可以抑制VCAM-1陽性細胞數的增加。見圖6、圖7。

3.6Pae對LPS誘導的VECs分泌TNF-α的影響LPS顯著上調TNF-α的表達(P<0.05)；Pae作用VECs后，顯著下調了由LPS誘導的TNF-α表達，尤以10 μg/mL Pae組的作用最為顯著(P<0.05)。見圖8。

注:含有相同右上標符號的組別相比較，P>0.05；不含相同右上標符號的組別相比較，P<0.05。

圖5　Pae對LPS誘導的VECs表達NF-κB的影響(n=5)

圖6Pae對LPS誘導的VECs

表達VCAM-1的影響(DAB染色，10×10倍)

4討論

VECs內襯于血管內壁，發揮著屏障保護作用，也是機體內最大的內分泌腺，能夠分泌各種細胞炎性因子、黏附分子等血管活性物質，是多種血管性疾病的關鍵參與者，VECs的損傷及功能障礙被認為是AS形成的始動因素[10]。當刺激因子作用于VECs導致損傷，VECs出現黏附功能障礙，單核細胞向VECs聚集和黏附是AS炎性反應的早期表現之一。正常情況下的單核細胞難以與VECs黏附，當某些刺激因素介導損傷時才易發生。LPS與VECs上受體結合，誘導細胞黏附因子、炎性因子等在VECs細胞表面表達上升，引起間接損傷，促使單核細胞的黏附及炎癥的發生、發展。

注:含有相同右上標符號的組別相比較，P>0.05；不含相同右上標符號的組別相比較，P<0.05。

圖7Pae對LPS誘導的VECs

表達VCAM-1的影響(n=5)

注:含有相同右上標符號的組別相比較，P>0.05；不含相同右上標符號的組別相比較，P<0.05。

圖8Pae對LPS誘導的VECs分泌TNF-α的影響(n=5)

研究表明，LPS作為炎性刺激因子，可與髓樣分化蛋白-2(myeloid differential protein-2, MD-2)蛋白結合形成緊密復合物，使得TLR4激活。TLR4受體是介導炎性反應的跨膜受體，是介導LPS的門戶蛋白，當TLR4與相應配體結合，發出相關傳遞信號，會激活NF-κB信號通路傳導級聯。NF-κB是細胞炎性反應中許多基因轉錄活化的必需因子，在炎性反應中具有關鍵和核心的調控作用，能促進相應細胞因子基因表達上調，如TNF-α、VCAM-1[11]。VCAM-1大量表達會促進單核細胞向內皮細胞黏附、遷移，在進展期促進已遷入病灶的單核細胞滾動、T淋巴細胞的激活，并增加其他細胞與細胞間的相互作用，促進AS的發生發展。TNF-α可刺激VECs上調表達VCAM-1和細胞間黏附分子-1(ntercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)，導致內皮細胞和白細胞黏附，白細胞遷移、粒細胞脫顆粒和毛細血管通透性增強，并遷移至炎癥部位，引起VECs損傷并誘導IL-1、IL-6、IL-8等細胞因子釋放，使中性粒細胞趨化，細胞變形，促進炎性反應，造成VECs損傷。

本研究以LPS作為刺激因子誘導VECs損傷，發現LPS可上調TLR4 mRNA的表達，并活化NF-κB信號通路，引起TNF-α和VCAM-1的釋放；而Pae可以下調LPS誘導TLR4 mRNA的過表達，降低NF-κB信號通路的活化、降低TNF-α和VCAM-1的釋放。該結果提示，Pae可能通過部分抑制TLR4與LPS在細胞膜上的結合，減少LPS進入胞漿內誘導信號的傳遞，降低NF-κB的活化，從“外層”保護VECs。Pae對TNF-α的釋放和VCAM-1基因的轉錄的抑制表明，Pae下調TLR4/NF-κB信號通路可引起下游細胞因子和黏附分子釋放減少；而TNF-α和VCAM-1水平的降低是影響VECs損傷及其與單核細胞黏附功能的重要因素。因此，Pae可以抑制單核細胞向VECs的黏附，保護內皮細胞，達到抗AS的作用。

參考文獻：

[1]Ross R.Atherosclerosis an inflammatory disease[J].New Engl J Med，1999，340(2)：115-119.

[2]褚現明，李冰，安毅，等.炎癥與動脈粥樣硬化關系研究進展[J].中國分子心臟病學雜志，2010，11(3)：184-188.

[3]李丹，李玉潔，楊慶，等.血管內皮功能障礙與動脈粥樣硬化研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18(8)：272-276.

[4]劉雅蓉, 陳君君, 戴敏, 等. 丹皮酚通過 miR-21 介導的 p38MAPK 信號通路下調氧化低密度脂蛋白誘導的大鼠血管內皮細胞腫瘤壞死因子-α 釋放[J]. 安徽中醫藥大學學報, 2014, 33(1): 51-56.

[5]Sugiyama K，Muroi M，Tanamoto K. A novel TLR4-binding peptide that inhibits LPS-induced activation of NF-kappa B andinvivotoxicity[J].Eur J Pharmacol，2008，594(1-3)：152-156.

[6]陳君君，戴敏，陳鵬.丹皮酚對脂多糖誘導大鼠血管內皮細胞黏附的影響[J].中藥材，2013，36(3)：436.

[7]邢國勝，房德敏，周詠梅，等.丹皮酚的制備及藥理作用研究進展[J].中草藥，2006，37(11)： 311-314.

[8]劉建文.藥理學實驗方法學：新技術與新方法[M].北京：化學工業出版社，2003：258-268.

[9]潘禮龍，戴敏，王偉．大鼠主動脈內皮細胞原代培養的研究[J].中國藥理學通報，2007，23(3)：410-413．

[10]Davignon J，Ganz P. Role of endothelial dysfunction in atherosclerosis[J].Circulation，2004，109(23 Suppl 1)：Ⅲ27-Ⅲ32.

[11]Yan ZQ. Regulation of TLR4 expression is a tale about tail[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(12)：2582-2584.

·實驗研究·

Effects of Paeonol on Lipopolysaccharide-Induced Release of Vascular Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 and Tumor Necrosis Factor-Alpha and TLR4/NF-κB Signaling Pathway in Rat Vascular Endothelial Cells

YANGLi,DAIMin,CHENPeng

(KeyLaboratoryofXin’anMedicineJointlySupportedbyMinistryofEducationandAnhuiProvince&SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of paeonol (Pae) on lipopolysaccharide (LPS)-induced release of vascular endothelial cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and toll-like receptor-4 (TLR4)/nuclear factor-kappa B (NF-κB) signaling pathway in rat vascular endothelial cells (VECs) and to reveal the molecular mechanism for inhibition of VECs adhesion by Pae. MethodsRat VECs were isolated by means of tissue predigested adherent method and LPS was used to induce inflammatory injury in VECs. Serum containing Pae was obtained from healthy rats which were given Pae by intragastric administration. Serum level of Pae was determined by reversed-phase high-performance liquid chromatography. The expression of TLR4 mRNA was measured by RT-PCR. The expression of NF-κB was determined by electrophoresis mobility shift assay. The expression of VCAM-1 was determined by immunohistochemistry and the expression of TNF-α was determined by radioimmunoassay. ResultsAfter 24 hours of treatment with Pae-containing serum (2.5 μg/ml, 5 μg/ml, and 10 μg/ml), the expression of NF-κB and TLR4 mRNA and the secretion of VCAM-1 and TNF-α in LPS-treated VECs were inhibited in a dose-dependent manner. Particularly, serum containing 10 μg/ml Pae had a significant inhibitory effect (P<0.05). ConclusionPae reduces the release of VCAM-1 and TNF-α probably through down-regulating the LPS-induced activation of TLR4/NF-κB signaling pathway.

[Key words]paeonol; vascular endothelial cell; lipopolysaccharide; TLR4/NF-κB signaling pathway; vascular endothelial cell adhesion molecule-1; tumor necrosis factor-alpha

收稿日期：(2014-11-10；編輯：曹健)

通信作者：戴敏，daiminliao@163.com

作者簡介：楊黎(1990-)，男，碩士研究生

基金項目：國家自然科學基金項目(81473386，81274134)

[中圖分類號]R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.01.016