SIRT1在NMDA誘導的皮層神經元凋亡中的作用觀察

衛美辰，楊小榮

SIRT1在NMDA誘導的皮層神經元凋亡中的作用觀察

衛美辰，楊小榮

摘要：目的觀察沉默信息調節因子(silent information regulator 1，SIRT1)在NMDA誘導的大鼠皮層神經元凋亡中的作用。方法培養大鼠原代皮層神經元，給予NMDA(100 μmol/L，2 h)建立興奮性神經毒模型；應用Caspase-3活性分析和Annexin V染色方法，檢測細胞凋亡。結果SIRT1激活劑白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)拮抗NMDA引起的細胞凋亡，而SIRT1抑制劑Sirtinol(10 μmol/L)取消RSV(25 μmol/L)的保護作用。結論在NMDA誘導的細胞凋亡過程中，激活SIRT1發揮保護作用，而抑制SIRT1則參與神經損傷。

關鍵詞：沉默信息調節因子1；NMDA；細胞凋亡；神經保護

NMDA誘導的興奮性神經毒造成神經損傷，并導致神經細胞的死亡，早期認為主要以壞死為主。NMDA也可通過引起凋亡參與興奮性神經毒引起的神經元死亡[1]。沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)作為NAD+依賴的脫乙酰基酶，通過對組蛋白及多種非組蛋白的去乙酰化修飾，參與基因轉錄、能量代謝以及細胞衰老過程的調節[2，3]。近年研究發現，SIRT1具有明顯的神經保護作用。但SIRT1對NMDA誘導的皮層神經元凋亡是否發揮保護作用尚不明確。

本研究采用NMDA(100 μmol/L，2 h)興奮毒細胞模型誘導細胞凋亡，應用Caspase-3活性分析和Annexin V染色方法檢測細胞凋亡，通過給予SIRT1激活劑白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)和/或 SIRT1抑制劑Sirtinol，觀察SIRT1在NMDA誘導的皮層神經元凋亡中的作用。

1材料與方法

1.1試劑Neurobasal和B27添加劑購自Gibco，Caspase-3活性檢測試劑盒購自Abcam，guava Nexin試劑盒購自Guava，RSV和Sirtinol購自Sigma。

1.2方法

1.2.1細胞培養取新生1 d～3 d的大鼠，常規手術，分離制成大鼠皮層單細胞懸液。細胞懸液經1 000 g離心5 min，棄上清，用培養液重懸細胞，按5×104個/mL的濃度，在37 ℃、5%CO2的條件下進行培養。

2結果

2.1SIRT1在NMDA引起Caspase-3活性增高中的作用預先應用SIRT1抑制劑Sirtinol(10 μmol/L)與神經元預孵育2 h，之后加入SIRT1激活劑RSV(25 μmol/L)再孵育12 h，采用Caspase-3活性測定細胞凋亡。結果顯示，RSV可以有效抑制NMDA引起的Caspase-3活性增高，使Caspase-3活性降低33.63%(P<0.05)；Sirtinol可以有效阻斷RSV的作用；NMDA受體拮抗劑MK-801完全阻斷NMDA的作用。詳見圖1。

圖1　SIRT1在NMDA引起Caspase-3活性增高的作用

2.2SIRT1在NMDA引起細胞凋亡中的作用Annexin-V染色結果顯示，用RSV預處理后，NMDA誘導的細胞早期凋亡和晚期凋亡比例分別降低了22.9%和72.1%；而Sirtinol拮抗了這種作用；MK-801完全阻斷NMDA的作用。詳見圖2。

圖2　SIRT1在NMDA引起細胞凋亡中的作用

3討論

谷氨酸作為中樞神經系統一種重要的神經遞質，當在突觸間隙中過度積聚時，可以激活突觸后膜NMDA受體，使胞外Ca2+內流，激活多種蛋白酶，過度產生自由基。這些因素共同作用，引起神經元損傷甚至死亡，產生興奮性神經毒效應[4]。越來越多的證據表明，NMDA誘導的神經細胞死亡是一個完善且有效的神經損傷模型，它是引起多種神經退行性疾病的一種重要發病機制[5]。

SIRT1是在哺乳動物中首先被發現的Sirtuin去乙酰化酶家族成員，也是目前研究最多、最為深入的Sirtuin蛋白。現有研究已證實SIRT1在腦缺血、AD、HD和PD等多種神經損傷模型中具有明顯的保護效應[6-8]。但SIRT1在NMDA誘導的皮層神經細胞凋亡中是否發揮保護作用尚不明確。

本實驗結果顯示，SIRT1激動劑RSV能夠拮抗NMDA誘導的神經細胞凋亡，表現為使NMDA誘導的Caspase-3活性降低，細胞凋亡減少；而SIRT1抑制劑Sirtinol能夠阻斷RSV對NMDA損傷的拮抗效應，說明RSV 的保護作用是通過活化SIRT1而實現的。因此，在NMDA誘導的細胞凋亡過程中，激活SIRT1發揮保護作用，而抑制SIRT1則參與神經損傷。

SIRT1作為一種去乙酰化酶，可以作用于P53、NF-κB、PGC-1α、LKB1、TSC2、HSF1等多種底物使其發生去乙酰化，參與多種損傷過程的調節。相關研究顯示，SIRT1可以通過去乙酰化凋亡激活蛋白FOXOs來抑制其轉錄，使神經元細胞免于凋亡[9]；SIRT1通過使HSF1(heat shock factor 1，HSF1)去乙酰化，促進HSF1與Hsp70啟動子結合，激活Hsp70，減少細胞凋亡[10]。

SIRT1可能通過其去乙酰化作用調節多種轉錄調節因子的活性，從而對各種神經損傷發揮保護作用。

參考文獻：

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[10]Donmez G，Arun A，Chung CY，et al.SIRT1 protects against alpha-synuclein aggregation by activating molecular chaperones[J].J Neurosci，2012，32(1)： 124-132.

(本文編輯王雅潔)·綜述與進展·

·基礎醫學論著/研究·

收稿日期：(2014-07-22)

通訊作者：楊小榮，E-mail：842904087@qq.com

中圖分類號：R338R285

文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2015.13.009

文章編號：1672-1349(2015)13-1498-02

作者單位：山西醫科大學(太原 030001)

1.2.2NMDA毒性誘導將培養神經元在NMDA(100 μmol/L)和Gly(10 μmol/L)溶液中孵育2 h，再進行后續的細胞凋亡檢測。SIRT1激活劑RSV在NMDA誘導之前預孵育12 h，SIRT1抑制劑Sirtinol在RSV孵育前2 h加入。

1.2.3Caspase-3活性測定將細胞接種在96孔板中，在NMDA作用后的20 h，用Caspase-3檢測試劑盒測定細胞的Caspase-3活性。在PBS中漂洗、收集細胞；在50 μL細胞裂解液中孵育細胞10 min后，再離心5 min(10 000 g)。取上清測定蛋白濃度，將每個蛋白樣品(50 μg～200 μg)稀釋至50 μL細胞裂解液中；將50 μL的2×反應緩沖液(含10 mmol / L的DTT)加入各樣品中；再加入5 μL的DEVD-pNA(4 mmol / L)底物溶液，并在37 ℃作用1.5 h；最后在(400～405)nm處測定OD值。

1.2.4Annexin-V染色將細胞接種在96孔板中，在NMDA作用后的24 h，用Annexin-V染色方法檢測細胞凋亡。在PBS中收集、重懸細胞；在100 μL細胞懸浮液中加入100 μL 的Nexin試劑，室溫避光反應20 min；通過Guava系統獲得細胞樣品。活細胞(Annexin V-/7-AAD- )、早期凋亡細胞(Annexin V+/7-AAD-)、晚期凋亡/死亡細胞(Annexin V+/7-AAD+)和核碎片(AnnexinV/7-AAD+)分布的百分比用Guava Nexin軟件進行分析。