小鼠來源的OX40融合蛋白的表達鑒定及優化表達

杜雪梅，蘇毅，王曉燕，趙蕾，鞠吉雨，唐華平，馮永堂(青島市市立醫院，山東青島6607;濰坊醫學院免疫學教研室)

小鼠來源的OX40融合蛋白的表達鑒定及優化表達

杜雪梅1，蘇毅1，王曉燕1，趙蕾1，鞠吉雨2，唐華平1，馮永堂2
(1青島市市立醫院，山東青島266071;2濰坊醫學院免疫學教研室)

摘要:目的鑒定及優化表達小鼠來源的OX40融合蛋白。方法將已構建好的pET32a-OX40重組質粒DNA轉入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，涂于含Amp平板篩選出陽性克隆，經Western blotting鑒定融合蛋白，對陽性克隆株通過改變異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃度、培養溫度及時間條件，觀察目的融合蛋白表達的變化。結果轉化的質粒經Western blotting鑒定，證實有目的蛋白表達。當溫度、時間不變時，IPTG分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L，7個不同濃度實驗結果以0.4mmol/L時蛋白表達量最高。當IPTG濃度、時間不變時，在20、25、30、35、40℃不同的溫度點，以30℃時蛋白表達量最高。當溫度、IPTG濃度不變時，1、2、3、4、5、6 h不同時間點，以4 h時蛋白表達量最高。結論小鼠來源的OX40融合蛋白在BL21細胞獲得成功表達，并獲得其最佳表達條件(IPTG濃度0.4mmol/L、溫度30℃、誘導4 h)。

關鍵詞:OX40融合蛋白; pET32a-OX40重組質粒DNA;大腸桿菌BL21;動物試驗doi: 10.3969/j.issn.1002-266X.2015.35.008

機體的免疫應答過程中，T細胞活化除了需要MHC-抗原肽外，還需要其他一些共刺激分子的協同參與，其中OX40/OX40L是一對近年來備受重視的新型共刺激分子［1］。OX40介導的共刺激信號在T細胞初次和再次免疫應答中都發揮重要作用，可以促進CD+4T細胞的活化、增殖、遷移，延長其壽命，并促進生發中心的形成和細胞的分化成熟［2，3］。OX40主要表達在被抗原激活的特異性T細胞上，其生物學功能主要是強化和維持效應特異性T細胞對抗原的特異性免疫應答，OX40表達和生物學功能的特殊性使其成為一個理想的免疫干預靶點［1］。如果對OX40及其配體間的相互作用進行不同的干預措施，可能是提高或抑制免疫應答能力及治療某些疾病的有效途徑之一。本研究將已構建的小鼠來源的OX40原核表達載體轉入大腸桿菌，對其表達的融合蛋白進行鑒定，并對影響誘導表達的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)濃度、溫度及時間條件進行了優化探索，以便為該蛋白的批量表達、純化及下一步單克隆抗體的制備提供最佳條件。

1　材料與方法

1.1主要試劑IPTG(Gibco公司);中分子量蛋白Marker(上海生化所);甘氨酸、二硫蘇糖醇、考馬斯亮藍R-250、瓊脂糖(西班牙產品分裝)、Tween-20(Amresco分裝)、Tris(Amresco分裝)均購自上海生工生物工程公司;抗-His·tag單抗(Novagen公司);dAB顯色試劑盒(北京天為時代公司)。HRP標記的兔抗小鼠IgG(Jackson公司);丙烯酰胺、N，N-亞甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸(Bio-Rad公司)。

1.2質粒及菌株DH5α由濰坊醫學院免疫學教研室凍存，重組質粒pET32a-OX40(經鑒定無誤)由濰坊醫學院免疫學教研室構建并凍存。

1.3大腸桿菌BL21(DE3)感受態的制備及轉化用CaCl2法制備大腸桿菌感受態，分裝成200 μL的小份，貯存于－70℃下備用。取200 μL感受態細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上，加入pET32a-OX40重組質粒DNA(含量不超過50 ng，體積不超過10 μL)，輕輕搖勻，冰上放置30min、42℃水浴中熱擊90 s后迅速置冰上冷卻3～5min，向管中加入1mL LB液體培養基(不含抗生素)，混勻后37℃振蕩培養1 h，使細菌恢復正常生長狀態取100 μL涂布于含抗生素的篩選平板上，正面向上放置，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37℃培養16～24 h。

1.4小鼠來源的OX40融合蛋白的小量誘導表達及鑒定分別接種轉化有pET32a-OX40重組質粒的單個菌落及相應的空白質粒對照單菌落pET32a(+)于5mL LB(Amp +)液體培養基中，37℃、160 r/min，振

蕩培養過夜。次日以1∶100的比例轉種于新鮮的LB(Amp +)液體培養基中，于37℃、220 r/min培養至OD600約為0.6后，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L(待定)，繼續培養3 h(待定)。離心收集菌體:取1.5mL菌液于已滅菌的1.5mL Eppendorf管中，12 000 r/min離心5min后取菌體沉淀，沉淀加上樣緩沖液水煮5min，與上清一同經SDS-PAGE電泳分析，然后進行Western blotting鑒定。

1.5融合蛋白大量誘導IPTG濃度的優化接種轉化有pET32a-OX40重組質粒的單個菌落于5mL LB(Amp +)液體培養基中，37℃、160 r/min，振蕩培養過夜。次日以1∶100的比例轉種于新鮮的LB(Amp +)液體培養基中，于37℃、220 r/min培養至OD600約為0.6后，加入IPTG使終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L，37℃(待定)繼續培養3 h(待定)，離心收集菌體:取1mL菌液于已滅菌的1.5mL Eppendorf管中，12 000 r/min離心5min后取菌體沉淀，SDS-PAGE電泳分析，其余的離心沉淀－70℃凍存備用。

1.6融合蛋白大量誘導溫度條件的優化同上搖菌至OD600約為0.6后，加入IPTG至終濃度為0.3mmol/L，分別于20、25、30、35、40℃振蕩培養3 h(待定)，同上收集菌體，SDS-PAGE電泳分析。

1.7融合蛋白大量誘導時間條件的優化同上搖菌至OD600約為0.6后，加入0.3mmol/L IPTG，于28℃分別振蕩培養1、2、3、4、5、6 h，同上收集菌體，SDS-PAGE電泳分析。

1.8不同條件誘導表達融合蛋白的SDS-PAGE電泳上樣樣品處理取1.5mL細菌離心后的菌體沉淀以滅菌的PBS(pH7.4)洗滌3次，以100 μL PBS(pH7.4)重懸，超聲破菌。超聲條件:工作3 s、間歇3 s，連續99次，冰浴超聲，超聲結束，12 000 r/min離心30min，分別保留胞質上清和包涵體沉淀。胞質上清和培養基上清各加20 μL 1×SDS凝膠上樣緩沖液混勻，沉淀加40 μL 1×SDS凝膠上樣緩沖液混勻，和蛋白分子量標準一起于沸水浴中煮沸5min，12 000 r/min離心5min，取上清20 μL上樣。

2　結果

2.1 pET32a-OX40重組質粒DNA的轉化及融合蛋白的表達和鑒定pET32a-OX40重組質粒DNA轉入大腸桿菌BL21后，在IPTG濃度為0.5mmol/L、溫度37℃、誘導3 h條件下可獲得OX40融合蛋白的表達。誘導后pET32a、誘導前pET32a、誘導后全菌體、胞質上清、誘導后包涵體、培養基上清分別經SDS-PAGE電泳分析顯示:重組載體經誘導后在蛋白Marker的42.7～66.2 kD出現新的融合蛋白條帶，融合蛋白主要存在于細胞內，未能分泌到細胞外，細胞內的融合蛋白主要存在于包涵體中，細胞質中未見到明顯可溶性目的蛋白(圖1)。包涵體經Western blotting鑒定，可以看到一明顯的條帶，表明融合蛋白可與抗-His·tag的一抗發生特異性結合，說明我們獲得OX40胞外段融合蛋白的表達產物。SDS-PAGE電泳結果表明融合蛋白主要存在于細胞內的包涵體中。

圖1　pET圖32a-OX圖40誘導表達及融合蛋白分布情況的SDS-PAGE電泳分析結果

2.2 IPTG濃度對小鼠OX40融合蛋白表達的影響

當溫度、時間不變時，IPTG分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol/L，7個不同濃度實驗結果以0.4mmol/L時蛋白表達量最高(圖2)。

圖2　不同IPTG濃度誘導的分析結果

2.3溫度條件對小鼠OX40融合蛋白表達的影響當IPTG濃度、時間不變時，在20、25、30、35、40℃不同的溫度點，以30℃時蛋白表達量最高(圖3)。

2.4培養時間對小鼠OX40融合蛋白表達的影響當溫度、IPTG濃度不變時，在1、2、3、4、5、6 h不同時間點，以4 h時融合蛋白的表達量最高(圖4)。

圖3　不同溫度誘導的分析結果

圖4　不同時間誘導的分析結果

3　討論

在機體的免疫應答過程中，OX40/OX40L作為一對重要的共刺激分子，為T、B細胞的激活提供了重要的共刺激信號［4，5］。由于OX40/OX40L在機體的免疫應答和自身免疫性疾病的發生發展中發揮重要作用，并隨著生物學功能的進一步揭示逐漸成為臨床干預自身免疫性疾病、移植排斥反應和腫瘤的一個理想靶點［6～10］;通過對其干預所進行的免疫治療在自身免疫病動物模型上已經取得可喜的效果［1，7，11］。

本試驗利用該室自己構建的帶有His·tag標簽的pET32a-OX40重組質粒轉入大腸桿菌BL21，經Western blotting檢測融合蛋白可與抗-His·tag的一抗發生特異性的結合，說明獲得了OX40融合蛋白表達產物。當然，對于融合標簽的檢測只是一個利于純化的相對特異性標記，后續我們將以抗-OX40的抗體或OX40L對表達產物的特異性作進一步確認。由電泳圖可見，融合蛋白主要存在于菌體超聲破碎后的沉淀物即包涵體中，包涵體是變性的不溶性顆粒，其主要成分為表達產物，其次還有菌體膜蛋白、脂質、多糖核酸物質以及RNA聚合酶等雜質。以包涵體形式表達的重組蛋白生產具有以下優勢［12］:①包涵體具有高密度且在水溶液通常不溶解，有利于表達產物的分離純化。②重組蛋白以包涵體的形式表達，有效抵御了宿主菌蛋白酶對表達產物的降解。③對于生產那些處于天然構象時對宿主細胞有毒害的蛋白時，包涵體的形成無疑是最佳選擇。外源基因在大腸桿菌中的高效表達與培養條件密切相關，環境條件不僅對菌體的生長和代謝有影響，還會影響到宿主、表達載體和外源基因三者之間的關系，從而影響外源基因的高效表達。

為提高OX40融合蛋白在大腸桿菌中的表達量和包涵體的純度，我們對培養時間、溫度、IPTG濃度等條件進行優化，以求獲得最大量的蛋白表達。一般認為高溫(42℃)會促進包涵體的形成，但我們反復摸索的實驗條件發現，30℃時OX40融合蛋白的表達量較高;加入不同濃度的IPTG，目的蛋白的表達量差別不是特別明顯，當IPTG濃度為0.4mmol/L時表達量稍高;在誘導培養的不同時間取樣觀察發現，隨著時間的延長，目的蛋白的表達量明顯增加，4 h時達最高值，繼續誘導，目的蛋白表達量反而降低。因此，我們選擇的誘導參數是溫度30℃、IPTG濃度0.4mmol/L、誘導時間4 h，在此條件下OX40融合蛋白的表達量占菌體總蛋白的20%左右，獲得了較理想的表達條件。

總之，小鼠來源的OX40融合蛋白的鑒定及高效表達條件的優化不僅為進一步批量獲取和純化目的蛋白提供了技術參數，而且也為制備OX40單克隆抗體以及進行相關的橫向研究打下了良好的基礎，這在未來的基礎和臨床研究中將有極好的開發應用前景。

參考文獻:

［1］Weinberg AD.OX40: targeted immunotherapy-implications for autoimmunity and enhancing vaccines［J］.Trends Immunol，2002，23(2): 102-109.

［2］Tanaka H，Demeure CE，Rubiom，et al.Humanmonocyte-deriveddendritic cells induce naive T celldifferentiation into T helper cell type 2(Th2)or Th1/Th2 effectors.Role of stimulator/responder ratio［J］.Expmed，2000，192(3): 405-412.

［3］Chen AI，McAdam AJ，Buhlmann JE，et al.OX40-ligand has a critical costimulatory role indendritic cell: T cell interactions［J］.Immunity，1999，11(6): 689-698.

［4］Kaurd，Brightling C.OX40/OX40 ligand interactions in T-cell regulation and asthma［J］.Chest，2012，141(2): 494-499.

［5］GoughmJ，Weinberg AD.OX40(CD134)and OX40L［J］.Adv Expmed Biol，2009，(647): 94-107.

［6］張雪琨，王勤，張學光.OX40/OX40L信號與自身免疫性疾病［J］.中國免疫學雜志，2012，28(2): 172-176.

［7］Humphreys IR，Walzl G，Edwards L，et al.A critical role for OX40 in T cell-mediated immunopathologyduring lung viral infection［J］.J Expmed，2003，198(8): 1237-1242.

通信作者:唐華平，馮永堂

文章編號:1002-266X(2015)35-0025-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R378.2