轉染Smad3-siRNA的活化肝星狀細胞Smad3表達及細胞外基質分泌量變化

李萍，王俊嶺，江智龍，楊秋輝，劉丹，李斯(天津市第二人民醫院，天津市肝病醫學研究所，天津00000; 天津醫科大學研究生院;天津中醫藥大學)

轉染Smad3-siRNA的活化肝星狀細胞Smad3表達及細胞外基質分泌量變化

李萍1，王俊嶺2，江智龍3，楊秋輝2，劉丹3，李斯3
(1天津市第二人民醫院，天津市肝病醫學研究所，天津300000; 2天津醫科大學研究生院;3天津中醫藥大學)

摘要:目的轉染Smad3-siRNA的活化肝星狀細胞(HSCs)Smad3表達及細胞外基質分泌量變化。方法利用生物軟件進行Smad3mRNA模擬，選擇合適的靶位點，使用pSilencer3.1-H1-hygro載體表達Smad3特異性siRNA。將Smad3-siRNA真核表達載體轉染HSC-T6細胞株，將HSC-T6細胞接種到24孔培養板，待細胞生長融合達60%～80%后，每3孔為1組，共分為4組，HSC-T6組細胞未經過質粒轉染;空白質粒組細胞經過不含Smad3-siRNA的空白質粒轉染; 1 μg Smad3-siRNA轉染組細胞經過含有1 μg Smad3-siRNA的質粒轉染; 2 μg Smad3-siRNA轉染組細胞經過含有2 μg Smad3-siRNA的質粒轉染。應用RT-PCR法、Western blotting法分別檢測Smad3mRNA和蛋白，同時檢測細胞上清膠原Ⅲ。結果成功構建siRNA表達克隆。HSC-T6組、空白質粒組、1 μg Smad3-siRNA組、2 μg Smad3-siRNA組的Smad3mRNA相對表達量分別為0.98±0.06、0.98±0.10、0.72±0.10、0.31±0.15，Smad3蛋白相對表達量分別為0.98±0.01、0.96±0.02、0.73±0.03、0.30±0.02，膠原Ⅲ含量分別為33.11±0.45、33.55± 1.00、17.93±1.05、11.80±1.31，1 μg Smad3-siRNA組、2 μg Smad3-siRNA組分別與HSC-T6組比較，1 μg Smad3-siRNA組、2 μg Smad3-siRNA組分別與空白質粒組比較，1 μg Smad3-siRNA組與2 μg Smad3-siRNA組比較，P均＜0.05。結論在體外實驗中真核表達載體Smad3-siRNA可有效地抑制HSCs中Smad3的表達，并可減少激活的HSCs分泌細胞外基質。

關鍵詞:肝星狀細胞; Smad3-siRNA真核表達載體;轉化生長因子β

研究［1］顯示，活化的肝星狀細胞(HSCs)是肝纖維化的細胞學基礎，轉化生長因子β(TGF-β)信號途徑在肝臟纖維化中發揮重要作用。Smad3在信號傳輸途徑中處于中樞地位，將TGF-β的信號傳遞到核內，調節靶基因的轉錄并誘導下游基因的表達［2，3］。RNA干擾技術為研究內源性基因功能和信號轉導途徑提供了強有力的研究工具。本研究針對Smad3基因設計RNAi的真核表達載體，特異性干擾Smad3的基因的表達，以確定其能否對活化的HSCs產生作用。

1　材料與方法

1.1細胞株、質粒含H1啟動子的轉錄載體pSilencer3.1-H1-siRNAhygro質粒購于美國Ambion公司，HSC-T6細胞株由美國紐約西奈山醫學院Friedman教授惠贈。

1.2主要試劑T4DNA連接酶、T4磷酸激酶、SalⅠ(大連寶生物公司)，脂質體轉染試劑Metafectene(德國Biontex公司)，膠原ⅢELISA試劑盒(Uscnlife公司)。

1.3設計軟件采用Ambion公司的設計軟件設計合成針對Smad3基因shRNA的寡核苷酸序列。有效靶序列: 5'-AACGTGAACACCAAGTGCATT-3'(Smad3mRNA第492位，GenBank NM_016769)。DNA寡核苷酸單鏈按照表達shRNA的原則設計，由上海博亞生物技術有限公司合成。其shRNA的DNA Olig: 5'-GATCCGCGTGAACACCAAGTGCATTCTATGGACAAATGCACTTGGTGTTCACGTTTTTTGTCGACA-3'互補鏈3'-GCGCACTTGTGGTTCACGTAAGATACCTGTTTACGTGAACCACAAGTGCAAAAAACAGCTGTTCGA-5'內含BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ酶切位點。正、負DNA寡核苷酸單鏈經退火后可形成具有黏性末端的DNA雙鏈，磷酸化處理后，并可進一步與經BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后的pSilencer3.1-H1-hygro載體連接，轉化DH5α大腸桿菌，挑取重組陽性克隆行酶切鑒定及測序鑒定。構建成轉錄siRNA的質粒以及實驗空白對照質粒。

1.4 Smad3-siRNA真核表達載體轉染待細胞生長融合達60%～80%后，利用脂質體Metafectene轉染表達siRNA pSilencer3.1-H1-hygro質粒，混合比例為

1∶4(質量∶體積)，轉染步驟按說明書進行。轉染后6 h，換為含10%胎牛血清的DMEM培養基，48 h后抽提總RNA和總蛋白進行檢測。

1.5 HSC-T6細胞Smad3mRNA檢測采用RTPCR法。將HSC-T6細胞接種到24孔培養板，待細胞生長融合達60%～80%后，每3孔為1組，共分為4組，HSC-T6組細胞未經過質粒轉染;空白質粒組細胞經過不含Smad3-siRNA的空白質粒轉染; 1 μg Smad3-siRNA轉染組細胞經過含有1 μg Smad3-siRNA的質粒轉染; 2 μg Smad3-siRNA轉染組細胞經過含有2 μg Smad3-siRNA的質粒轉染。各組干預48 h后，24孔板每孔加人500 μL TRIzol試劑，靜置5min。槍頭吹打后吸入離心管中，加人100 μL氯仿，離心后取上清加人異丙醇沉淀，抽提總RNA。Smad3引物使用Primer Premier5.0設計。序列: 5'-GAACGGGCAGGAGGAGAAAT-3'、5'-CCACAGGCGGCAGTAGATGA-3'，208 bp，反應條件為50℃、30min，94℃、4min，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、2min，30個循環，72℃、10min。RT-PCR產物以1%的瓊脂糖凝膠電泳。以β-actin為內參照基因，正義鏈: 5'-CGCTGCGCTGGTCGACA-3';反義鏈: 5'-GTCAGGCACGATTTCCCGCT-3'，目的基因620 bp。mRNA表達采用Gel Scan軟件進行灰度掃描，半定量分析。

1.6 HSC-T6細胞Smad3蛋白檢測采用Westernblotting法。將HSC-T6細胞接種到24孔培養板，待細胞生長融合達60%～80%后，每3孔為1組，共分為4組，HSC-T6組細胞未經過質粒轉染;空白質粒組細胞經過不含Smad3-siRNA的空白質粒轉染; 1 μg Smad3-siRNA轉染組細胞經過不含Smad3-siRNA的空白質粒轉染; 2 μg Smad3-siRNA轉染組細胞經過含有2 μg Smad3-siRNA的質粒轉染。各組經48 h轉染后，提取細胞蛋白，按照Biod-ford法測定蛋白水平。跑SDS-PAGE膠后，轉膜1 h，5%的脫脂奶粉封閉2 h，以5%的脫脂奶粉稀釋一抗Smad3抗體Santa Cruz公司(1∶200)，室溫孵育2 h，4℃過夜;次日PBS洗10min×3，以辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗1∶2 000(5%的脫脂奶粉稀釋)室溫孵育2 h，PBS洗10min×3，ECL化學發光法顯色。β-actin為內參照蛋白。蛋白表達采用Gel Scan軟件進行灰度掃描，半定量分析。

1.7 HSC-T6細胞培養上清中膠原Ⅲ檢測Smad3-siRNA轉染HSC-T6細胞48 h后，按照說明書收取細胞上清液利用ELISA方法測定膠原Ⅲ含量。

1.8統計學方法采用SPSS15.0統計軟件。符合正態分布的計量資料珋x±s表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，實驗組各組間是否存在顯著性差異分析采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

經酶切鑒定，質粒Psilence3.1-H1-hygro序列里面2727的位置是有一個SalⅠ的酶切位點的，而在我們的插入序列里面設計了SalⅠ的酶切位點，如果插入正確，就應該能夠被SalⅠ酶切出兩條DNA條帶，一條2 170 bp，另一條2 382 bp;而質粒Smad3-siRNA能被SalⅠ酶切出兩條DNA條帶，即均為插入正確的質粒。挑取已轉化的質粒菌種測序。經測序，結果完全符合設計要求，詳見圖1。各組HSCT6細胞Smad3mRNA、蛋白表達及細胞上清中膠原Ⅲ含量比較見表1。

圖1　Smad圖3-siRNA重組質粒酶切鑒定電泳圖

表1　各組HSC-T6細胞Smad3mRNA、蛋白表達及細胞上清中膠原Ⅲ含量比較()

表1　各組HSC-T6細胞Smad3mRNA、蛋白表達及細胞上清中膠原Ⅲ含量比較()

注:與HSC-T6組比較，*P＜0.05;與空白質粒組比較，△P＜0.05;與1 μg Smad3-siRNA組比較，#P＜0.05。

組別　Smad3mRNA　Smad3蛋白　　膠原Ⅲ(μg/mL)HSC-T6組0.98±0.06　0.98±0.01　33.11±0.45空白質粒組　0.98±0.10　0.96±0.02　33.55±1.00 1 μg Smad3-siRNA組　0.72±0.10＊△　0.73±0.03＊△　17.93±1.05＊△2 μg Smad3-siRNA組　0.31±0.15＊△#　0.30±0.02＊△#11.80±1.31＊△

3　討論

盡管肝纖維化的防治和治療研究取得了很大的進步，但是肝纖維化仍然是威脅人類健康的一個重要疾病。RNA干擾技術已被廣泛應用于基因治療和功能基因組學的研究中，并顯示出良好的效果［4］。以載體形式在體內表達shRNA，是一種產生RNA干擾的良好方式，它與化學合成的雙鏈RNA作用一致，且持續時間長、費用低，故適于推廣應用［5，6］。siRNA除了可在哺乳動物細胞水平上阻斷

基因的表達外，在動物水平上亦可特異而高效地抑制外源基因和內源基因(轉基因鼠)的表達［7～9］。本實驗選擇Smad3基因，根據文獻［10］的siRNA設計原則和Ambion網站提供的設計原則及設計軟件設計siRNA進行干擾研究。

活化的HSCs在肝纖維化過程中起關鍵作用，是肝纖維化的細胞學基礎。為增加siRNA的穩定性，我們設計了轉錄發夾狀siRNA的DNA質粒，并且在5'端進行了磷酸化，因5'端磷酸化的siRNA其活性明顯高于非磷酸化的siRNA。測序和酶切結果表明，含有發夾狀siRNA的質粒序列與我們設計的相符。結果表明，我們設計的siRNA對Smad3產生了很好的抑制效果，轉染表達RNAi干預HSC-T6細胞48 h后，Smad3mRNA、蛋白隨干預劑量的增加表達下降，與空白質粒組及HSC-T6組比較，P均＜0.05。同時，2 μg Smad3-siRNA組與1 μg Smad3-siRNA組相比，P＜0.05。空白對照無論在RNA水平還是在蛋白水平上都沒產生抑制作用，表明siRNA作用是序列特異性的。

另有研究［11，12］顯示，Smad7具有抑制肝纖維化進展的作用，而Smad3參與肝纖維化進展。在Smad3受到阻斷后，是否有其他Smad蛋白或信號傳導通路如骨形態發生蛋白在起作用尚需要深入研究。本研究發現，細胞培養上清液中的膠原Ⅲ含量在1 μg Smad3-siRNA組與2 μg Smad3-siRNA組有明顯下降，且空白質粒組及HSC-T6組比較P均＜0.05。同時，2 μg Smad3-siRNA組與1 μg Smad3-siRNA組相比P＜0.05。TGF-β1是組織纖維化病變中最重要的促發因子之一，TGF-β1相繼與TGFβ-Ⅱ型受體、TGFβ-Ⅰ型受體結合，再與Smad2、Smad3結合，最后與Smad4結合形成異多聚體，才能進入核中調節轉錄活動。Smad3信號通路在調控TGF-β1介導的細胞外基質沉積過程中處于十分重要的地位，能介導TGF-β1信號傳導，調節肝纖維化［13～15］。本實驗表明阻斷Smad3表達，使TGF-β1信號通路傳導障礙，造成了HSCs膠原分泌的減少。因此，靶向調整Smad3的表達水平能有效降低肝細胞外基質，有望成為臨床防治肝纖維化的一個有效途徑。

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·臨床研究·

收稿日期:( 2015-04-18)

通信作者:李萍

文章編號:1002-266X(2015)35-0031-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R575

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.35.010