早產兒不同濃度氧暴露后外周血單個核細胞內p47phox蛋白與活性氧產生的相關性研究*

張玲萍，董文斌

（四川醫科大學附屬第一醫院新生兒科，四川 瀘州 646000）

·論著·

早產兒不同濃度氧暴露后外周血單個核細胞內p47phox蛋白與活性氧產生的相關性研究*

張玲萍，董文斌

（四川醫科大學附屬第一醫院新生兒科，四川 瀘州 646000）

目的觀察早產兒不同濃度氧暴露后，外周血單個核細胞（PBMCs）內p47phox蛋白變化與活性氧（ROS）產生的相關性。方法32周以下早產兒不同濃度氧療48 h后，分離PBMCs，檢測PBMCs內p47phox的定位情況、p47phox蛋白表達量及ROS的生成量。結果p47phox隨著吸氧濃度升高向細胞膜移位增加；p47phox的蛋白表達量及ROS生成量也隨著吸氧濃度的升高而增加。結論早產兒氧暴露后，p47phox可能通過更多的向胞膜移位，增加其表達量來引起ROS產生的增加。

早產兒；氧暴露；p47phox；活性氧

近年來，早產兒出生率顯著提高，早產兒因為肺發育不成熟需要不同方式的氧療支持。也正是因為這種通氣策略的改變，早產兒存活率也得到顯著的升高。可是，長期高濃度供氧引起早產兒急、慢性肺損傷卻凸顯出來。有研究顯示，高氧誘導的氧化應激反應，產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）是其重要的發病機制[1-2]。機體產生活性氧有多種途徑，其中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶是血管內生成活性氧的主要酶體[3]，同時也在肺血管內皮細胞內表達，這種表達有助于高氧誘導活性氧生成后，肺組織發生炎癥反應和組織損傷[4]。NADPH氧化酶是由多亞基構成的酶復合體，其中p47phox是NADPH氧化酶活性有關的重要調節因子。當機體受到細胞因子、激素及炎癥等因素的刺激，p47phox會發生一系列變化，最終攜帶胞質復合體定位在胞膜上，從而激活NADPH氧化酶，產生大量的活性氧[5-6]。本研究旨在觀察早產兒不同濃度氧暴露后，外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）內p47phox蛋白定位及表達量的變化，與ROS的生成量的情況，來探討p47phox蛋白變化與活性氧產生的關系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

離心機（北京醫用離心機廠），超凈工作臺（Thermo公司），倒置相差顯微鏡（Olympus公司），熒光顯微鏡（Olympus公司），激光共聚焦顯微鏡（Leica公司），全光譜分光光度儀（Eppendorf，德國），電泳儀（美國伯樂），GDS8000凝膠掃描系統（UVP，美國），超低溫冰箱（Thermo公司）等。

1.2 主要試劑

人淋巴細胞分離液（灝洋生物制品科技有限責任公司），Mitosox Red（Invitrogen公司），DAPI（Sigma公司），抗熒光淬滅封片劑（碧云天公司），兔抗人p47phox抗體（Bioworld Technology），FITC山羊抗兔IgG（中杉金橋公司），5XSDS上樣緩沖液（上海生工），蛋白裂解液（北京普利萊），10%分離膠（Amersham Pharmacia Biotech公司），4%濃縮膠（Amersham Pharmacia Biotech公司），X-光膠片（柯達公司），HRP二抗（GenScript公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶內參一抗（GenScript公司）等。

1.3 研究對象及分組

以2013年收治于我科的32周以下早產兒為對象。將其中入院時診斷為新生兒呼吸窘迫綜合癥[7]且需要吸氧的患兒作為氧暴露組，根據吸氧濃度不同分為3組：FiO2<30%為低濃度吸氧組、FiO2在30%～40%為中濃度吸氧組、FiO2>40%為高濃度吸氧組。同期選擇10例32周以下無其他疾病且暫未吸氧的早產兒作為對照組。兩組患兒胎齡、出生體重差異無統計學意義，具有可比性。該實驗通過四川醫科大學附屬第一醫院倫理委員會的批準，所有患兒進行實驗前均征得家屬同意并簽署知情同意書。

1.4 實驗方法

1.4.1 標本采集氧暴露組早產兒吸氧48 h后，對照組患兒出生48 h后，均經橈動脈采血2 ml，置于肝素抗凝管中，采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMCs。

1.4.2 熒光顯微鏡檢測PBMCs內p47phox定位經Ficoll密度梯度離心法分離得到PBMCs后，用少量RPIM 1640培養液（含10%胎牛血清）重懸細胞，采用計數板調節細胞濃度為2×106個/ml；取100μl細胞懸液滴于防脫玻片上，觀察細胞貼附于玻片時，滴加少量4%多聚甲醛覆蓋住細胞層，固定20 min；洗滌細胞后，加入50μl封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育15min；洗滌細胞后，將磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）稀釋的p47phox抗體（1∶50）滴加于載玻片上，覆蓋住細胞層，4℃冰箱過夜；次日，將FITC標記的山羊抗兔抗體稀釋后（1∶50）滴于載玻片上，37℃濕盒溫育1 h；洗滌細胞后，滴入30μl抗熒光淬滅劑封片并采用熒光顯微鏡采集圖像。Image Pro Plus軟件中的Line Profile（光譜廓線）測定細胞內熒光強度分布[8]。

1.4.3 Western-blot檢測PBMCs內p47phox蛋白表達量收集細胞，加入適量放射免疫沉淀分析裂解液。冰上操作后，高速離心，提取蛋白；紫外分光光度計，595 nm，1號管調零，制出標準曲線，標準方程及R值，測量待測蛋白OD值，算出蛋白濃度；制備分離膠、蛋白上樣、電泳、轉膜及封閉；取出聚偏二氟乙烯膜，緩沖液沖洗后，暗室內進行化學發光，膠片曝光顯影后收集結果。然后用UVP凝膠圖象處理系統Labworks 4.6軟件分析目的條帶的灰度值[9]。

1.4.4 熒光顯微鏡檢測PBMCs內ROS水平首先將分離得到的PBMCs調整濃度為2×106個/ml。取100μl滴加于防脫玻片上，4%多聚甲醛固定20 min，洗滌細胞；按說明書配制Mito SOX探針，濃度為3.85μg/ml，滴加1 ml覆蓋住細胞層，37℃孵育30 min，洗滌細胞；每張玻片加入100μl DAPI藍色熒光染料染細胞核，3 min后，洗滌細胞；滴加30μl抗熒光淬滅劑于載玻片上進行封片，激光共聚焦顯微鏡采集圖像；Image Pro Plus軟件測定圖像平均熒光強度，其熒光強度越強，ROS表達越多[10]。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計學處理。計數資料采用率表示，χ2檢驗進行統計分析；計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，方差分析進行統計，組間比較采用q檢驗；兩變量間的關系采用直線相關進行分析；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光檢測PBMCs內p47phox定位

采用Image Pro Plus軟件中的LineProfile測定細胞內熒光強度分布（圖1）。對照組（見圖A）中，細胞1和2由1條直線穿過，對直線經過區域的熒光強度分布進行測定，結果發現，熒光強度曲線呈平臺狀均勻分布（A1、A2所示），說明p47phox主要均勻分布于胞質中；低濃度吸氧組中，細胞熒光強度曲線也呈平臺狀，分布較均勻（B1、B2所示）；而中濃度吸氧組組中，部分細胞熒光強度曲線呈平臺狀（C1所示），p47phox在胞質分布均勻，部分細胞熒光強度曲線呈兩側高中間低的雙峰狀（C2所示），說明p47phox在胞膜附近先升高，胞質中降低，靠近胞膜處又升高，此時p47phox已主要聚集在胞膜附近，此為發生了p47phox移位的陽性細胞；而高濃度吸氧組中，細胞熒光強度分布呈明顯的雙峰狀，（D1、D2所示），p47phox向胞膜移位的陽性細胞更加明顯。

由于各組中p47phox移位的陽性細胞數不同，本實驗前期結果已對其移位率進行了統計。對照組發生p47phox移位的細胞數僅為1.02%；低濃度吸氧組p47phox移位率為7.69%；中濃度吸氧組p47phox移位率為21.69%；而高濃度吸氧組中，p47phox移位率為53.07%，明顯高于其他3組（P<0.05）[11]。

2.2 Western-blot檢測PBMCs內p47phox表達量

Western blot結果顯示，吸氧濃度的升高可誘導p47phox蛋白表達上調。對照組p47phox蛋白相對表達量為（0.26±0.024），低濃度吸氧組、中濃度吸氧組及高濃度吸氧組p47phox表達逐漸增加，分別為（0.70±0.028）、（0.81±0.013）及（0.84±0.023）。經統計，各組間p47phox蛋白表達差異具有統計學意義，F=144.49，P<0.01。與對照組相比，其余3組p47phox蛋白表達明顯增加，P<0.05。且高濃度吸氧組中p47phox蛋白表達明顯高于中濃度吸氧組和低濃度吸氧組，P<0.05。見圖2。

2.3 熒光顯微鏡檢測PBMCs內ROS水平

對照組患兒PBMCs內ROS平均熒光強度為（14.60±0.76）；低濃度吸氧組為（18.34±0.19）；中濃度吸氧組為（23.11±0.84）；高濃度吸氧組為(32.88± 1.32)（見圖3）。隨著吸氧濃度的升高，ROS的產生逐漸增加。與對照組相比，差異均具有統計學意義；且任何兩組間平均熒光強度均有差別（均P<0.05）。

2.4 p47phox蛋白表達與ROS產生的相關性分析

臨床中早產兒氧暴露48 h后，隨著吸氧濃度的升高，PBMCs內ROS逐漸升高。同時氧濃度的升高還誘導p47phox蛋白表達上調，這與ROS升高的趨勢是一致的。經直線相關進行分析后，得到相關系數r=0.78，P<0.05，p47phox蛋白表達與ROS的產生呈顯著的正相關關系。

圖1 免疫熒光檢測p47phox在PBMCs內定位（×400）

圖2 外周血單個核細胞內p47phox相對表達量

圖3 外周血單個核細胞內活性氧水平（×200）

圖4 p47phox蛋白表達與ROS含量的散點圖

3 討論

氧療，是呼吸支持的重要方式。但長期高濃度用氧引起的急、慢性肺損傷是造成早產兒尤其是極低出生體重兒死亡或致殘的重要原因。有研究顯示，在高氧環境機體發生氧化應激反應，產生大量ROS是其發病的重要機制。NADPH氧化酶是一種過氧化物酶，廣泛存在于吞噬細胞及非吞噬細胞，其催化產物ROS就是參與氧化應激損傷的重要因素。NADPH氧化酶主要由5個亞基組成，包括胞膜組分gp91phox、p22phox，胞質組分p40phox，p47phox，p67phox和小分子的GTP結合蛋白Rac-1或Rac-2[12]。當細胞受到相應刺激后，胞漿亞基p47phox發生磷酸化，構象發生改變與p67phox組裝并向胞膜轉位，與胞膜亞基p22phox結合，從而激活了NADPH氧化酶，將氧分子還原為單線態氧[13-14]，進而引起氧化應激，造成組織細胞損傷。在此ROS的產生過程中，胞漿亞基p47phox起著樞紐性的作用。因此，本實驗通過早產兒氧暴露后，觀察PBMCs內p47phox的變化與ROS的產生，來探討p47phox與ROS產生的關系。

前期研究發現，早產兒氧暴露后，隨著吸氧濃度的升高，p47phox向胞膜移位的細胞數增多。在機體受到刺激的情況下，p47phox向胞膜的移位率增加，這與國內外眾多研究是相一致的。隨著研究不斷地深入，筆者進一步在實驗中發現，隨著患兒用氧濃度升高，該組患兒PBMCs內p47phox表達在逐漸增加。同時，ROS也在逐漸增多。這與p47phox的表達量是呈正相關的。這提示，用氧濃度的升高不僅可能增加p47phox向胞膜移位，還可能誘導p47phox蛋白表達上調。而p47phox可能通過增加向胞膜移位，上調其表達量，激活更多的NADPH氧化酶，產生更多的活性氧，加重早產兒機體組織的損傷。通過對這種機制的進一步探索，有助于從源頭上控制過多活性氧的產生，以期為預防早產兒肺組織發生炎癥反應或其他多種氧化應激損傷性疾病提供新的治療靶點和臨床思路。

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Study on the relationship between p47phox and ros within pbmcs in premature infants after oxygen therapy*

Ling-ping ZHANG,Wen-bin DONG
(Department of Geriatrics,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou,Sichuan 646000,P.R.China)

【Objective】To observe the correlation of p7phox and ROS in PBMCs after different concentration oxygen exposure in preterm infants.【Methods】After oxygen therapy for 48 h in extremely premature infants.We isolated PBMCs from peripheral blood.Then detected the location and expression of p47phox and ROS within PBMCs.【Results】The higher oxygen concentrated,the more PBMCs have p47phox translocate to membrane,the expression of p7phox and ROS production raised as well.【Conclusion】After oxygen therapy,p47phox may increase the translocation,up-regulate expression to cause reactive oxygen species increasing.

premature infants;oxygen expose;p47phox;ROS

1005-8982（2015）34-0001-05

R72；R392

A

2015-05-25

國家自然科學基金（No：81571480）；中華兒科雜志第二屆雙鶴珂立蘇科研基金（No：cjp2011-009）；四川省衛生廳科研基金（No：110340）

董文斌，E-mail：DongWenbin2000@163.com