益氣溫陽活血方對慢性心力衰竭心室重塑患者外周血單個核細胞Bax/Bcl-2表達的影響*

卞震炯，楊冬花

（1.貴陽中醫學院第二附屬醫院心內科，貴州 貴陽 550003；2.貴州省人民醫院干醫科，貴州 貴陽 550002）

·論著·

益氣溫陽活血方對慢性心力衰竭心室重塑患者外周血單個核細胞Bax/Bcl-2表達的影響*

卞震炯1，楊冬花2

（1.貴陽中醫學院第二附屬醫院心內科，貴州 貴陽 550003；2.貴州省人民醫院干醫科，貴州 貴陽 550002）

目的探討益氣溫陽活血方對慢性心力衰竭心室重塑患者外周血單個核細胞（PBMC）BCL-2相關X蛋白（BCL2-Associated X Protein，Bax）/B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）表達的影響。方法將慢性心力衰竭患者122例隨機分為治療組和對照組，兩組均按慢性心力衰竭治療指南給予常規治療，治療組加服用益氣溫陽活血方，治療共3個月。兩組治療前后分別以心臟超聲檢查患者左心室收縮末徑（LVESD）、舒張末徑（LVEDD）和左心室射血分數（LVEF），逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法以及蛋白免疫印記法（Western-blot）檢測Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白質表達水平。結果3個月后，與治療前比較，對照組、治療組治療后LVESD、LVEDD、Bax mRNA及蛋白質表達水平降低，而LVEF、Bcl-2 mRNA及蛋白質表達水平則升高，差異均有統計學意義（P<0.05），且治療組治療后上述指標與對照組治療后比較進一步改善，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論益氣溫陽活血方通過下調Bax基因表達以及上調Bcl-2基因表達抑制慢性心力衰竭患者心室重塑，改善心臟功能。

心室重塑；Bax；Bcl-2；益氣溫陽活血方；臨床研究

慢性心力衰竭是大多數心血管疾病的最終歸宿，也是最主要的死亡原因。近年來的研究表明，心肌細胞凋亡在心力衰竭的發生、發展及心室重塑方面起著重要作用[1]。Bax/Bcl-2為細胞凋亡相關基因，Bcl-2抑制細胞凋亡，而Bax則促進細胞凋亡，Bcl-2與Bax的比例決定細胞是否發生凋亡[2]。前期研究發現，益氣溫陽活血方可減少心力衰竭大鼠內皮素-1、升高一氧化氮及一氧化氮合酶的水平，阻斷鈣調磷酸神經激酶（calcineurin，CaN）信號通路活化抑制心室重塑[3-4]，但是否能通影響慢性心力衰竭患者PBMC Bax/Bcl-2的表達抑制心室重塑，目前尚不清楚。本研究通過觀察益氣溫陽活血方對慢性心力衰竭心室重塑患者PBMC Bax/Bcl-2表達的影響，為進一步臨床運用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2012年12月-2014年12月貴陽中醫學院第二附屬醫院心血管內科住院及門診慢性心力衰竭患者122例，心功能II～IV級（依照紐約心臟病協會分級），所有病例診斷均參照2007年《中國慢性心力衰竭診斷治療指南標準》，按隨機分組原則分為慢性心力衰竭常規治療組（對照組）和慢性心力衰竭常規治療加益氣溫陽活血方組（治療組）。治療組64例。其中，男34例，女30例；年齡53～84歲（66±10）歲；心功能II級22例，III級26例，IV級16例；冠心病28例，高血壓性心臟病18例，糖尿病性心肌病12，擴張型心肌6例。對照組58例。其中，男31例，女27例；年齡54～83歲（65±11）歲；心功能II級20例，III級24例，IV級14例；冠心病26例，高血壓性心臟病17例，糖尿病性心肌病10，擴張型心肌5例。兩組患者性別、年齡、體重指數、血壓、血脂、血糖及肝腎功能等一般資料比較差異無統計學意義（P> 0.05）。排除先天性心瓣膜病、風濕性心瓣膜病、甲亢性心臟病、結核性心包積液、慢性阻塞性肺疾病、非脂肪肝性肝功能不良、嚴重腎功能不全、近期1個月內有重大創傷、手術、感染、腫瘤及血液疾病患者。所有入選者均征得同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

淋巴細胞分離液（中國醫學科學院血液學研究所），Trizol（Invitroge公司），Rnasin（Promega公司），M-MLV（Promega公司），引物由上海生物工程公司合成，Bax和Bcl-2一抗抗體（Santa Cruz公司），ECL顯影試劑盒（Santa Cruz公司），制膠、電泳及轉膜儀（Bio-Rad公司），PCR儀（Eppendorf公司），酶標儀（Bio-Rad公司），超聲心動圖診斷儀2500型（美國惠普公司）。

1.3 方法

1.3.1 治療方法兩組均按慢性心力衰竭治療指南給予常規治療，包括利尿劑、血管緊張素酶抑制劑、β受體阻滯劑及洋地黃等。治療組在常規治療基礎上，加用益氣溫陽活血方，處方：人參30 g，黃芪30 g，桂枝9 g，丹參30 g，益母草30 g，紅花6 g，白術15 g，澤瀉9 g，茯苓15 g，葶藶子9 g，炙甘草6 g。每天1劑，水煎，頭煎加水500 ml，取汁150 ml，2煎加水400 ml，取汁100 ml，2煎混勻，分3次口服。兩組共用藥3個月。

1.3.2 心臟結構及心功能測定兩組受試對象治療前和治療結束后采用惠普2500超聲心動圖診斷儀，探頭頻率3.2 MHz，指定具有豐富經驗的專業技術人員操作，測定左心室收縮末徑（Left ventricular end systolic diameter，LVESD）、舒張末徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）和左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF），連續3次，取其平均值。

1.3.3 PBMC的分離取兩組受試對象治療前和治療結束后外周血4 ml，肝素抗凝，按淋巴細胞分離液常規Ficoll密度梯度離心分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。

1.3.4 Bax、Bcl-2 mRNA的表達Bax（500 bp）正向：5'-CCCACCAGCTCTGAACAGTTC-3'，反向：5'-C CAGCCACAAAGATGGTCAC-3'；Bcl-2（369 bp）正向5'-CTTCGCCGAGATGTCCAG-3'，反向5'-GGCTCA GATAGGCACCCA-3'；GAPDH（300 bp）正向5'-CAT CTCTTGCTCGAAGTCCA-3'，反向：5'-ATCATGTTTG AGACCTTCAACA-3'。按Trizol試劑說明書提取PBMC總RNA，參照第一鏈cDNA合成試劑盒說明書進行逆轉錄反應，然后進行PCR反應。取PCR產物5μl進行瓊脂糖凝膠電泳、照相，利用UVP凝膠掃描儀測定條帶的吸光度（A）值，以目的基因與GAPDH條帶的吸光度（A）值的比值代表其表達的相對量。

1.3.5 Bax、Bcl-2蛋白質的表達提取PBMC蛋白質，制備聚丙烯酰胺凝膠、蛋白電泳、轉膜。一抗濃度均為1∶1 000，二抗濃度為1∶2 000，化學發光試劑法曝光、顯影和定影，凝膠成像分析系統進行密度掃描并分析。

1.4 統計學方法

結果為計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用SPSS 19.0軟件分析處理，兩組治療后比較采用t檢驗，同組治療前后比較采用配對t檢驗，P< 0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組治療前后心臟結構、功能的比較

與治療前組內比較，對照組和治療組治療后LVESD、LVEDD縮小，LVEF則均提高，差異有統計學意義（P<0.05）。與對照組治療后比較，治療組治療后LVESD、LVEDD縮小，LVEF則提高，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表1。

2.2 兩組治療前后Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白質表達水平檢測

與治療前組內比較，對照組和治療組治療后Bax mRNA及蛋白質表達水平均降低，而Bcl-2 mRNA及蛋白質表達水平則均升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與對照組治療后比較，治療組治療后Bax mRNA及蛋白質表達水平降低，而Bcl-2 mRNA及蛋白質表達水平則升高，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表2。

Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白質表達的瓊脂糖電泳圖和聚丙烯酰胺凝膠蛋白質電泳圖，見圖1～4。

表1 兩組治療前后心臟結構、功能的比較（s）

表1 兩組治療前后心臟結構、功能的比較（s）

注：1）與治療前組內比較，P<0.05；2）與對照組治療后比較，P< 0.05

組別nLVEDD/mmLVESD/mmLVEF/%對照組治療前5859.69±2.7833.38±3.5144.17±4.03治療后治療組5857.62±3.081）30.54±2.851）47.00±3.771）治療前6460.04±3.0234.01±3.2143.37±4.32治療后6456.49±2.321）2）29.12±2.061）2）48.41±3.441）2）

表2 兩組治療前后Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白質表達水平檢測（±s）

表2 兩組治療前后Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白質表達水平檢測（±s）

注：1）與治療前組內比較，P<0.05；2）與對照組治療后比較，P< 0.05

組別nBax mRNA（相對量）Bcl-2 mRNA（相對量）Bax蛋白質（相對量）Bcl-2蛋白質（相對量）對照組治療前580.79±0.080.65±0.105.05±1.143.02±1.03治療后治療組58 0.63±0.101）0.74±0.111）3.11±1.061）4.62±1.061）治療前640.79±0.090.66±0.104.93±1.272.99±0.98治療后64 0.60±0.101）2）0.78±0.101）2）2.77±0.731）2）5.03±1.121）2）

圖1 Bax mRNA的表達

圖2 Bax蛋白質的表達

圖3 Bcl-2 mRNA的表達

圖4 Bcl-2蛋白質的表達

3 討論

細胞凋亡是細胞在自身基因調控下進行的一種主動死亡過程，故又稱程序性細胞死亡[5]。近年研究表明，心力衰竭時左室功能的不斷惡化是心肌細胞反復丟失和（或）剩余心肌細胞收縮功能逐漸退化的結果，而心肌細胞死亡是心肌細胞不斷丟失的根源所在，心肌細胞死亡使心肌細胞大量丟失導致心室重塑和心力衰竭[6]。

Bcl-2家族是與細胞凋亡緊密相關的基因家族，該家族的蛋白產物從功能上分為兩類：一類具有抑制凋亡作用，如Bcl-2基因，另一類則具有促進凋亡作用，如Bax基因[7]。Bcl-2是從濾泡B細胞瘤中克隆出的第一個抑制凋亡的蛋白，主要位于線粒體膜、滑面內質網及核膜上，可抑制多種原因引起的細胞程序性死亡[8]；Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員，是一個可溶性蛋白分子，主要位于細胞質中，當凋亡信號發生時，Bax從胞質中轉移到線粒體，并與線粒體膜相結合，發揮促凋亡作用，兩者蛋白水平的高低與凋亡調控直接相關[9]。有研究發現，心力衰竭心肌中Bcl-2蛋白表達下降92%，Bax蛋白表達增強52%，Bcl-2與Bax蛋白的比例下降[10]。

近年來研究發現，中醫藥在延緩心力衰竭、改善患者臨床癥狀、對抗心力衰竭西藥的不良反應上顯示了其獨特療效，并具有一定的優勢。比如中醫藥在干預病理性心肌凋亡、細胞肥大和心肌纖維化等方面療效肯定，同時中醫藥協同西藥，既可消除或減少血管緊張素轉化酶抑制劑和β受體阻滯劑的不良反應，又縮短了藥物劑量遞增的時間[11]。本實驗也發現，益氣溫陽活血方對慢性型力衰竭心室重塑患者凋亡相關蛋白的表達以及心臟結構和功能得到明顯改善，具體表現為促凋亡蛋白Bax的表達下調，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達上調，心臟射血分數增加，左室舒張末期內徑及左室收縮末期內徑下降。有研究發現，CaN通過影響Bad的磷酸化，拮抗Bcl-2家族抗凋亡作用[12]，或活化轉錄因子活化T細胞核因子3，使其由胞質轉位于胞核，介導凋亡相關基因的表達誘導心肌細胞凋亡[13]。前期研究也發現，益氣溫陽活血方可阻斷CaN信號通路活化抑制心室重塑[3]。故推測，益氣溫陽活血方通過阻斷CaN信號通路活化，調節凋亡基因Bax、Bcl-2的表達，改善慢性心力衰竭患者心臟功能、抑制心室重塑。具體機制有待于進一步研究。

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Effects of Yiqiwenyanghuoxue decoction on Bax/Bcl-2 of PBMC in chronic heart failure patiens with cardiac remodeling

Zhen-jiong BIAN1,Dong-hua YANG2
(1.Department of Cardiology,the Second Affiliated Hospital of Guiyang Traditional Chinese Medicine College,Guiyang,Guizhou 550003,P.R.China;2.Cardre Ward,Guizhou People's Hospital,Guiyang,Guizhou 550002,P.R.China)

【Objective】To study the effects Yiqiwenyanghuoxue decoction on Bax/Bcl-2 of PBMC in the cardiac remodeling of patients with chronic heart failure.【Methods】122 patients with chronic heart failure were randomly divided into control group and treated group.The control group were given conventional treatment,the treated group were given Yiqiwenyanghuoxue decoction and combined routine therapy,three months was taken as a course of treatment.LVESD,LVEDD and LVEF were measured by ultrasonic cradiography,mRNA and protein levels of Bax and Bcl-2 were evaluated with RT-PCR and Western-blot respectively.【Results】After 3 months,LVEDD, LVESD,mRNA and protein levels of Bax were decreased while LVEF,mRNA and protein levels of Bcl-2 were increased in both therapy group compared with those pre-therapy(P＜0.05,respectively),and the above indicators got further improvement in treated group compared with control group(P<0.05,respectively).【Conclusion】Yiqiwenyanghuoxue decoction could inhibit the myocardial remodeling through down-regulating Bax and upregulating Bcl-2.

cardiac remodeling;Bax;Bcl-2;decoction of Yiqiwenyanghuoxue;clinical research

1005-8982（2015）34-0006-04

R286

A

2015-04-13

貴州省科技聯合基金項目（黔科合中藥字[2012]LKZ7009號）