膜聯蛋白Ⅱ反義寡核苷酸對人膀胱癌BIU-87細胞膜聯蛋白Ⅱ表達及細胞侵襲力的影響

陳瀟雨，張威，屈穎偉，王鎖剛

（1.河南中醫學院第一附屬醫院泌尿外科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學第三附屬醫院病理科，河南 鄭州 450000）

·論著·

膜聯蛋白Ⅱ反義寡核苷酸對人膀胱癌BIU-87細胞膜聯蛋白Ⅱ表達及細胞侵襲力的影響

陳瀟雨1，張威2，屈穎偉1，王鎖剛1

（1.河南中醫學院第一附屬醫院泌尿外科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學第三附屬醫院病理科，河南 鄭州 450000）

目的探討膜聯蛋白Ⅱ（AnnexinⅡ）反義寡核苷酸（ASODN）對膀胱癌BIU-87細胞AnnexinⅡ基因表達及侵襲力的影響。方法設計合成AnnexinⅡASODN，采用脂質體將低、中及高濃度（6、12及18μmol/L）的AnnexinⅡASODNs分別轉染BIU-87細胞24、48及72 h，同時設空白對照組（不轉染）。采用免疫細胞化學與原位雜交法分別檢測各組細胞中AnnexinⅡ蛋白與mRNA的表達；采用MTT法檢測細胞增殖情況，計算細胞生長抑制率，采用Boyden chamber侵襲實驗檢測高濃度轉染72 h細胞侵襲力情況。結果與空白對照組相比，各轉染組細胞AnnexinⅡ蛋白和mRNA的表達均減弱，且差異均有統計學意義（P<0.05），且AnnexinⅡ蛋白及mRNA的表達隨AnnexinⅡASODN濃度的增加及轉染時間的延而減弱（P<0.05）；AnnexinⅡASODN轉染組細胞生長抑制率明顯增加（P<0.05）；細胞穿越Matrigel的細胞數交空白組減少，且差異均有統計學意義（P<0.05）。結論AnnexinⅡASODN可有效抑制膀胱癌BIU-87細胞AnnexinⅡ蛋白及mRNA的表達，抑制BIU-87細胞的生長及侵襲力。

膜聯蛋白Ⅱ；反義寡核苷酸；BIU-87細胞；侵襲力

膜聯蛋白（Annexin）Ⅱ屬于膜聯蛋白家族，參與信息轉導、DNA的合成、細胞骨架活動、細胞遷移及細胞增殖等[1-2]。研究表明，AnnexinⅡ基因的表達失調與多種腫瘤的發生發展密切相關[3-5]，已成為腫瘤治療的新靶點。作者利用反義寡核苷酸技術轉染膀胱癌BIU-87細胞，觀察其對細胞AnnexinⅡ基因表達及細胞侵襲力的影響，從而為分子靶向治療膀胱癌的提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌BIU-87細胞株由北京大學泌尿外科研究所惠贈，體積分數10%胎牛血清的RPM I 1 640培養液購上海克隆生物化學制品有限（北京）公司，Lipofecter脂質體轉染試劑購自碧云天生物技術研究所，全硫代修飾Annexin的反義寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，ASODN）（5'-ACACATCT GGTGACTTCCGCAA-3'）及AnnexinⅡmRNA生物素標記探針（5’-GGCCAATGTGTTCAACCAAGCGG -3’）由北京奧科生物技術有限責任公司合成，兔抗人AnnexinⅡ多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，PV-9000二步法免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，預雜交液、核固紅購自武漢博士德公司，堿性磷酸酶標記鏈親和素（alkaline phos phatase strep tavidin，APS）和5-溴-4-氯-3吲哚磷酸/顯色原硝基四氯唑藍（BC IP/NBT）購自美國Promega公司，Matrigel膠購于BD biosciences公司。

1.2 細胞分組培養及轉染

復蘇后的BIU-87細胞于RPMI 1 640培養液（含體積分數10%胎牛血清，青霉素100 u/L，鏈霉素100 u/L），37℃、5%二氧化碳CO2孵育箱內培養。實驗選用對數生長期細胞，待細胞長滿培養瓶后消化、以細胞數8×105/孔接著24孔培養板空培養。用Lipofecter脂質體將6μmol/L（低濃度）、12μmol/L（中濃度）及18μmol/L（高濃度）的AnnexinⅡASODN轉染BIU-87細胞24、48及72 h，并設空白對照組（不轉染）。

1.3 細胞滴爬片的制備

按實驗要求消化、收集24孔板中各組細胞，制成3.0×105個/ml的細胞懸液，取100μL細胞懸液滴到載玻片（經清洗、泡酸及高壓消毒）上，放入濕盒，置于細胞培養箱中培養8～9 h，待細胞貼壁后晾干，40 g/L多聚甲醛固定，4℃冰箱保存。

1.4 AnnexinⅡ蛋白的免疫細胞化學法檢測

參照PV9000二步法免疫組化試劑盒說明書操作，以PBS代替一抗為陰性對照，以已知AnnexinⅡ陽性表達的肝癌組織切片為陽性對照。AnnexinⅡ蛋白陽性信號定位于細胞質，呈棕黃色。高倍鏡下隨機選取10個視野，每個視野觀察細胞數不少于100個。按陽性細胞百分比及著色深淺進行結果判定[6]。評分標準：①陽性細胞百分比<1%為0分，～25%為1分，～50%為2分，～75%為3分，>75%為4分。②細胞顯色為0分，淡黃色為1分棕黃色為2分，棕褐色為3分。上述2種評分結果相乘，以積分值表示AnnexinⅡ蛋白的表達水平。

1.5 AnnexinⅡmRNA的原位雜交法檢測

參照原位雜交試劑盒說明書操作，以不含探針的預雜交液孵育的組織切片作陰性對照，用已知AnnexinⅡ陽性表達的肝癌組織作陽性對照。AnnexinⅡ原位雜交陽性信號定位于細胞質，呈藍紫色。高倍鏡下隨機選取10個視野，每個視野觀察細胞數不少于100個。按陽性細胞百分比及著色深淺進行結果判定[6]。陽性細胞數≤10%、～30%、～70%和>70%分別記為1、2、3和4分。按雜交信號強度分為弱、中和3級，分別記為1、2和3分。上述2種評分結果相乘，以積分值表示AnnexinⅡmRNA的表達水平。

1.6 四唑鹽比色試驗（MTT法）檢測細胞生長抑制率

96孔板收集對數生長期細胞，每空加入20μl MTT溶液和150μl二甲基亞砜后，按實驗要求處理細胞并培養至各時間點，酶標儀檢測各空光密度（D）值（λ=490 nm），每組設3個復孔，取均值，每組檢測10次。細胞生長抑制率=（1–轉染組D/對照組D）×100%。

1.7 Boyden chamber侵襲小室實驗

于6孔培養板中置放小室，用聚碳酸酯膜將上下室分開，膜上鋪設人工基底膜Matrigel 120 g/室（取50μl無血清1 640培養基用來稀釋），37℃環境中放置30～60 min，使其形成凝膠狀，可以仿制人體內細胞外基質和基底膜環境。再次使用無血清1640培養基沖洗2次。將高濃度轉染組轉染72 h及相應的對照組細胞懸液稀釋成濃度為5×105個/ml的單細胞懸液；每個小室加400μl稀釋好的各組單細胞懸液，每組細胞加3個小室；常規條件下培養24 h；取出小室，用棉簽小心擦凈膜上室面的膠和細胞，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色后，細胞面朝上貼附到載玻片上；顯微鏡下隨機計數5個高倍（400×）視野內的穿膜細胞數，計算平均值。

1.8 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析，資料用均數±標準差（x±s）表示；多組均數的比較均用方差分析，方差不齊時可用變量轉換來處理；兩組組均數的比較用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各種細胞AnnexinⅡ蛋白的表達

不同濃度AnnexinⅡASODN轉染組AnnexinⅡ蛋白的表達均低于對照組，且差異均有統計學意義（P<0.05）；不同濃度及不同轉染時間AnnexinⅡASODN轉染組間兩兩相比，AnnexinⅡ蛋白表達的差異均有統計學意義（P<0.05），且隨濃度的增加、轉染時間的延長而降低。見表1、圖1。

2.2 各組細胞AnnexinⅡmRNA的表達

不同濃度AnnexinⅡASODN轉染組細胞An nexinⅡmRNA的表達均低于對照組（P<0.05），且不同濃度及不同轉染時間AnnexinⅡASODN轉染組間兩兩相比，mRNA表達的差異均有統計學意義（P<0.05），且隨濃度的增高、時間的增加而減弱。見表2、圖2。

2.3 各種細胞生長抑制率的比較

不同濃度AnnexinⅡASODN分別轉染細胞24、48及72 h，各組細胞生長抑制率均高于空白對照組（均P<0.05），細胞生長抑制率隨轉染濃度的增高、轉染時間的延長而增高，且不同濃度及不同轉染時間各組兩兩相比，差異均有統計學意義（均P <0.05），見表3。

2.4 Boyden chamber體外侵襲試驗

AnnexinⅡASODN組細胞穿越Matrigel的細胞數少于空白對照組，且差異有統計學意義（P<0.05）。見表4、圖3。

圖1 3種不同濃度AnnexinⅡ轉染72 h后，各種細胞AnnexinⅡ蛋白的表達（PV，400×）

圖2 3種不同濃度AnnexinⅡ轉染72 h后，各組細胞AnnexinⅡmRNA的表達（BCIP/NBT，400×）

圖3 Boyden chamber體外侵襲實驗

表1 AnnexinⅡASODN對膀胱癌BIU-87細胞AnnexinⅡ蛋白的影響（±s）

表1 AnnexinⅡASODN對膀胱癌BIU-87細胞AnnexinⅡ蛋白的影響（±s）

組別24 h48 h72 hF值P值低濃度組5.98±0.465.14±0.484.36±0.538.1720.019中濃度組4.75±0.514.12±0.513.22±0.447.4560.024高濃度組空白對照組4.18±0.55 6.87±0.85 3.08±0.45 7.32±0.92 2.75±0.51 7.11±0.76 6.595 0.231 0.031 0.800 F值14.86043.12058.921 P值0.0020.0000.000

表2 AnnexinⅡASODN對膀胱癌BIU-87細胞AnnexinⅡmRNA的影響（±s）

表2 AnnexinⅡASODN對膀胱癌BIU-87細胞AnnexinⅡmRNA的影響（±s）

組別24 h48 h72 hF值P值低濃度組5.58±0.555.12±0.494.72±0.781.4480.307中濃度組4.86±0.524.07±0.523.88±0.652.5240.160高濃度組空白對照組3.54±0.57 6.69±0.43 2.85±0.43 6.82±0.61 2.45±0.54 6.92±0.86 3.414 0.092 0.102 0.913 F值32.61553.67934.342 P值0.0000.0000.000

表3 各組細胞生長抑制率的比較（n=30±s）

表3 各組細胞生長抑制率的比較（n=30±s）

組別抑制率/%F值P值24h48h72h空白對照組0.80±0.210.19±0.250.20±0.180.120.892低濃度處理組1.65±0.10 22.60±0.59 31.30±4.05 76.77<0.001中濃度處理組7.12±0.22 28.31±3.55 41.66±4.10 78.14<0.001高濃度處理組F值P 21.63±2.78 138.81 <0.001 45.89±3.88 182.02 <0.001 57.00±5.62 152.66 <0.001 49.87<0.001

表4 Boyden chamber體外侵襲試驗結果（±s）

表4 Boyden chamber體外侵襲試驗結果（±s）

組別穿膜細胞數ASODN組72.26±2.97空白對照組174.91±3.27 t值36.808 P值0.000

3 討論

目前，治療膀胱癌的主要方法主要是手術及術后化療藥物灌注，因膀胱癌的復發率高，致使不少患者反復手術，術后患者生活質量往往較差。近年來，對膀胱癌的診治水平有了很大的提高，但是淺表性膀胱腫瘤在復發率仍然居高不下，特別是晚期膀胱癌的預后依然較差，膀胱癌患者的死亡率呈逐年增加趨勢。所以，尋求治療膀胱癌的新方法是目前研究的熱點。

AnnexinⅡ是Annexin家族成員之一，Annexins是一類鈣依賴性的磷脂結合蛋白，參與細胞增殖、分泌、纖溶和細胞骨架連接等重要的生物學功能，但其確切的作用機制目前尚不十分明了。多項研究表明[7-9]，AnnexinⅡ在細胞增殖中起重要作用，在多種腫瘤組織中高表達，且其表達與年齡、組織分化、病理分級及淋巴結轉移呈正相關。有研究表明，AnnexinⅡ具有促進腫瘤侵襲及轉移的作用，可能與其是組織型纖溶酶原激活物、纖溶酶原及細胞粘合素C的受體有關[10]。AnnexinⅡ能夠與纖溶酶、纖溶酶原、組織型纖溶酶原激活物、組織蛋白酶B、細胞黏合素C及細胞外基質等相互作用，它們均與腫瘤的發展及轉移密切相關。通過AnnexinⅡ使以上多種蛋白酶及其底物在腫瘤細胞表面共區域化（colocalization），因此可降解腫瘤細胞外基質蛋白，導致腫瘤細胞從原發腫瘤脫離，造成遷移、侵犯局部組織或器官[11]。

反義核酸技術是近年來在基因治療研究中迅速發展起來的一項新技術，通過堿基配對原則在細胞內與特異性靶mRNA序列相結合，以干擾靶mRNA由細胞核向細胞漿轉運、促進RNA酶降解靶mRNA以及抑制相應蛋白質的翻譯，從而干擾靶基因的表達，甚至完全阻斷。本研究采用反應寡核苷酸技術，將AnnexinⅡASODN轉染膀胱癌BIU-87細胞，結果表明，AnnexinⅡASODN可明顯抑制膀胱癌BIU-87細胞AnnexinⅡ基因蛋白及mRNA的表達，且具有濃度及時間依賴性；AnnexinⅡASODN可明顯抑制膀胱癌細胞的生長，另外，Boyden chamber實驗結果表明，AnnexinⅡASODN可抑制膀胱癌BIU-87細胞的侵襲力，所以，應用反義寡核苷酸技術通過抑制AnnexinⅡ基因的表達，從而抑制腫瘤細胞的浸潤、轉移，達到治療腫瘤的目的成為可能，為臨床治療膀胱癌提供了新思路。

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Effect of AnnexinⅡASODN on the expression of AnnexinⅡgene and invasion of human bladder cancer BIU-87 cell

Xiao-yu CHEN1,Wei ZHANG2,Ying-wei QU1,Suo-gang WANG1
(1.Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou,Henan 450000,P.R.China;2.Department of Pathology,the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450000,P.R.China)

【Objective】To explore the effect of AnnexinⅡASODN on the expression of AnnexinⅡgene and invasion in human bladder cancer BIU-87 cells.【Methods】The oligonucleotide of AnnexinⅡASODN were designed firstly.Three different concentrations of AnnexinⅡASODN(6,12 and 18 μmol/L was used to transfect BIU-87 cells with different time exposure(24,48 and 72 h),and the control group were established accordingly by no transfection.The level of mRNA and protein of AnnexinⅡin the 6 groups were measured by insitu hybridization and immunocytochemistry.MTT method was used to detect the cell prolife ration and Boyden chamber invasion was used to detect t the BIU-87 cell invasion.【Results】Compared with the control groups,there were significant differences in the expressions of AnnexinⅡmRNA and protein of BIU-87 cells among the 3 groups at 24,48,and 72 h(P< 0.05),and increased with the increase of siRNA concentration and time exposure(P<0.05).Compared with the control groups,the growth inhibition rate of BIU-87 cells transfected with AnnexinⅡASODN for different time exposure was higher(P<0.05),and increased with the increase of ASODN concentration and time exposure(P<0.05).Compared with the control group,AnnexinⅡASODN group can inhibit the invasion force of bladder cancer BIU-87 cell, and the differences were statistically significant(P<0.05).【Conclusion】AnnexinⅡASODN could effectively knockdown the expression of AnnexinⅡ,which could significantly inhibit the invasion force of bladder cancer BIU-87 cell.

AnnexinⅡ;ASODN;bladder cancer BIU-87 cells;invasion

1005-8982（2015）34-0010-05

R737.14

A

2015-02-12

王鎖剛，E-mail：wangsuogang2005@126.com