α-硫辛酸對腦缺血再灌注大鼠的保護作用及可能機制研究

王夢旻，陶智，楊志紅，呂卉芳

（湖北省武漢市黃陂區人民醫院藥劑科，湖北 武漢 430300）

·論著·

α-硫辛酸對腦缺血再灌注大鼠的保護作用及可能機制研究

王夢旻，陶智，楊志紅，呂卉芳

（湖北省武漢市黃陂區人民醫院藥劑科，湖北 武漢 430300）

目的觀察α-硫辛酸對大鼠腦缺血再灌注的保護作用，對其作用機制進行初步探索。方法將SD大鼠隨機分為假手術組、模型組和實驗組，每組20只，采用線栓法制備缺血再灌注模型，實驗組于灌注前30 min腹腔注射α-硫辛酸20 mg/kg，假手術組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。觀察并比較兩組大鼠神經功能評分、心肌損傷標志物和氧化應激相關指標、NF-κB、TNF-α及Caspase-3表達水平。結果實驗組大鼠神經功能評分顯著低于模型組（P<0.05），差異具有統計學意義。實驗組大鼠cTnⅠ、MDA及GSH-Px含量顯著低于模型組，SOD含量顯著高于模型組（P<0.05），差異具有統計學意義。實驗組大鼠NF-κB、TNF-α和Caspase-3蛋白表達量顯著低于模型組（P<0.05），差異具有統計學意義。結論α-硫辛酸可改善腦缺血再灌注大鼠神經功能缺損，降低腦缺血再灌注誘導的氧化應激水平，提高腦細胞抗氧化能力，同時抑制Caspase-3介導的細胞調亡，從多途徑發揮腦缺血再灌注保護作用。

缺血再灌注；α-硫辛酸；cTnⅠ；MDA；GSH-Px；SOD；NF-κB；TNF-α；Caspase-3

缺血再灌注損傷是指在缺血基礎上恢復血流供應后組織損傷反而加重，甚至發生不可逆性損傷的現象[1]。氧化應激和炎性反應是造成神經功能缺損的重要原因，NF-κB是核心環節[2]。此外，Caspase-3作為細胞凋亡級聯反應的關鍵因子，在缺血再灌注損傷中起著重要作用[3]。本文通過線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，旨在研究α-硫辛酸對大鼠腦缺血再灌注的保護作用，初步探討其作用機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年SD大鼠60只。雌雄各半；體重220～250 g；購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，適應性飼養7 d后開始實驗。

1.2 實驗藥品

α-硫辛酸購自上海現代制藥股份有限公司，國藥準字H20045444。

1.3 實驗試劑和儀器

1.3.1 實驗試劑心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）檢測試劑盒購自南京基蛋生物科技有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測試盒購自南京建成生物工程研究所，Caspase-3一抗（Santa cruz公司，美國），山羊抗小鼠IgG（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3.2 實驗儀器酶標儀（Bio-RAD公司），電熱恒溫水浴箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠），離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），漩渦混勻器（蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司），電泳儀（Life Technologies公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物分組及給藥60只大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、模型組和實驗組，每組各20只。實驗組于灌注前30 min腹腔注射α-硫辛酸20 mg/kg，假手術組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4.2 大鼠缺血再灌注模型建立[4]大鼠術前12 h禁食不禁水。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后仰臥固定于手術臺，75%乙醇消毒頸部皮膚，沿頸部正中切開，暴露右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，在頸內和頸外動脈分叉處結扎頸外動脈分支。采用手術線結扎頸總動脈近心端，動脈夾夾閉左側頸內動脈，結扎并切斷左側頸外動脈，下拉近心端，與左側頸內動脈呈直線。將尼龍線插入頸內動脈達大腦中動脈，栓線的血管外部分結扎固定。阻斷血流90 min后拔除栓線，實現再灌注。假手術組結扎動脈但不插入栓線，其余操作同模型組。再灌后16 h處死大鼠檢測相關生化指標。

1.5 檢測指標

1.5.1 大鼠神經功能評分參照Longa 5分制評分標準評定神經功能。0分：無神經損傷；1分：左前肢伸展障礙；2分：向左打圈；3分：行走時向左側傾倒；4分：意識昏迷；5分：死亡。

1.5.2 心肌損傷標志物和氧化應激相關指標檢測取心臟組織進行如下檢測免疫熒光定量法檢測cTnⅠ含量，硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，比色法檢測GSH-Px活性。

1.5.3 TNF-α檢測取大鼠缺血腦組織采用免疫組化法檢測TNF-α含量。斷頭法處死大鼠，4%多聚甲醛固定后以視交叉前緣作2 mm厚冠狀位切片，脫水、透明、石蠟包埋，作4μm厚腦組織冠狀切片。石蠟切片脫蠟水化后滴加TNF-α一抗4℃過夜孵育，PBS沖洗3次，5 min/次。滴加生物素標記的二抗工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次。滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次。DAB顯色劑顯色15 min，蘇木素復染，免疫組化的定量分析采用灰度值分析。

1.5.4 NF-κB和Caspase-3檢測取大鼠缺血腦組織采用Western blot法檢測NF-κB和Caspase-3蛋白表達。斷頭法處死大鼠取腦組織，迅速置于預冷的生理鹽水中，洗去表面血跡。取缺血側大鼠腦組織，剪碎成2 mm×2 mm的小塊，置入勻漿器中勻碎。將勻漿液移至離心管中加入裂解液裂解10 min，4℃下13 000 r/min離心10 min，取上清液用于檢測。按照Bradford法檢測細胞總蛋白含量，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，分離膠電泳電壓80 V，濃縮膠電泳電壓100 V；轉膜電壓設置為90 V，120 min。5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，—抗按照1∶500稀釋后與膜4℃雜交過夜，二抗按照1∶2 000稀釋后與膜雜交90 min。孵育結束，TBST洗3次，每次15 min，加入顯影液暗室壓片后曝光。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，采用t檢驗或F檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較

隨著再灌注時間的延長，兩組大鼠神經功能評分不斷增高，表明再灌注加劇神經功能損傷。各時間點比較，實驗組大鼠神經功能評分顯著低于模型組（P<0.05），差異具有統計學意義，表明α-硫辛酸對再灌注后的神經損傷具有一定的保護作用。見表1。

表1 各組大鼠缺血再灌注后不同時間點神經功能評分比較（n=20，分±s）

表1 各組大鼠缺血再灌注后不同時間點神經功能評分比較（n=20，分±s）

注：覮與模型組比較，P<0.05

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2.2 各組大鼠血漿指標檢測結果比較

模型組大鼠心肌梗死標志物cTnⅠ和氧化應激指標MDA、GSH-Px含量顯著升高，SOD活性顯著降低，與假手術組比較差異具有統計學意義（P<0.05），表明心肌損傷和梗死同時存在，自由基損傷作用和抗氧化機制啟動。與模型組比較，實驗組大鼠cTnⅠ、MDA及GSH-Px明顯降低，SOD明顯增高（P< 0.05），表明α-硫辛酸對缺血再灌注誘發的氧化應激有明顯的抑制作用。見表2。

表2 各組大鼠血漿指標檢測結果比較（±s）

表2 各組大鼠血漿指標檢測結果比較（±s）

注：1）與假手術組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05

組別cTnⅠ/（μg/L）GSH-Px/（u/L）假手術組2.55±0.453.15±0.26227.43±16.72679.82±36.70模型組8.37±2.361）8.38±2.381）148.33±12.941）887.35±48.971）實驗組5.47±10.371）2）5.32±1.411）2）183.83±9.731）2）739.33±315.091）2）F值66.42553.659173.868137.694 P值0.000.000.000.00 MAD/（nmol/L）SOD/（u/L）

2.3 各組大鼠TNF-α檢測結果比較

與假手術組比較，模型組大鼠TNF-α蛋白表達量顯著升高（P<0.05），差異具有統計學意義。與模型組比較，實驗組大鼠TNF-α蛋白表達量顯著降低（P<0.05），差異具有統計學意義，表明α-硫辛酸可能通過抑制TNF-α表達從而抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應。見附圖及表3。

附圖 各組大鼠TNF-α檢測結果比較

表3 各組大鼠TNF-α檢測結果（±s）

表3 各組大鼠TNF-α檢測結果（±s）

注：1）與假手術組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05

組別TNF-α假手術組32.91±6.31模型組46.89±7.041）實驗組40.87±7.361）2）F值20.554 P值0.00

2.4 各組大鼠NF-κB和Caspase-3檢測結果比較

與假手術組比較，模型組大鼠NF-κB和Caspase-3蛋白表達量顯著升高（P<0.05），差異具有統計學意義。與模型組比較，實驗組大鼠NF-κB和Caspase-3蛋白表達量顯著降低（P<0.05），差異具有統計學意義，表明NF-κB和Caspase-3在缺血后遲發性神經元死亡中具有重要作用。見表4。

表4 各組大鼠NF-κB和Caspase-3蛋白表達量比較（±s）

表4 各組大鼠NF-κB和Caspase-3蛋白表達量比較（±s）

注：1）與假手術組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05

組別Caspase-3NF-κB假手術組1.20±0.141.29±0.33模型組3.74±0.891）3.26±0.911）實驗組2.68±0.641）2）2.29±0.711）2）F值79.96140.398 P值0.000.00

3 討論

隨著社會的不斷進步和生活方式的逐步改變，腦中風發病率在全球范圍內呈日益增長的趨勢，嚴重威脅人類健康。其中，缺血性腦中風是血栓形成或動脈栓子造成腦動脈的阻塞，進而造成局灶性腦缺血[4]。臨床治療缺血性腦中風以盡早恢復血流灌注為原則，但是，近年來研究發現，缺血后血流恢復會進一步加劇組織損傷和功能障礙，造成缺血再灌注損傷[5]。

α-硫辛酸是硫醇類化合物，兼具脂溶性和水溶性，口服和靜脈給藥均能良好吸收，可透過血腦屏障[6]。α-硫辛酸具有很強的抗氧化能力，是人體必不可少的抗氧化劑。研究顯示α-硫辛酸作用廣泛，可清除多種活性氧、螯合金屬離子、抗細胞凋亡及抗炎癥反應等，臨床主要用于治療糖尿病周圍神經病變[7]。近年來，多項研究表明α-硫辛酸預處理對多種組織器官缺血再灌注具有保護作用，如腎臟、心肌、肝臟和睪丸[8]。

氧化應激和炎性反應是缺血再灌注的重要機制。再灌注可導致自由基過度生成，細胞處于氧化應激狀態，引起蛋白質和核酸過氧化，最終導致細胞死亡[9]。此外，炎性細胞和炎性介質參與缺血再灌注損傷的全過程，加重腦組織損傷，炎性細胞包括中性粒細胞、單核細胞及巨噬細胞等，炎性因子包括IL-1、IL-8和TNF-α等。NF-κB幾乎存在于所有細胞內，是重要的核轉錄因子，參與免疫反應等過程。缺血再灌注損傷后釋放的上游炎癥因子，在IkBs激酶催化作用下IKB發生磷酸化，促使NF-κB激活進入細胞核與靶基因結合，從而釋放下游相關因子（如IL-1β和TNF-α），誘發炎癥反應，造成惡性循環[10]。細胞凋亡級聯反應受基因調控，其中Caspase-3是下游關鍵因子，被稱為“殺手蛋白”，在缺血再灌注損傷中發揮重要作用[11-12]。研究證實，鼠腦缺血后繼發有心肌損傷。國內外研究顯示病人腦出血后心肌酶譜改變于病后72 h之內變化最為明顯，1周后恢復正常。腦組織缺血可以直接累及丘腦及丘腦下部植物神經功能紊亂，兒茶酚胺分泌增加等引起內臟器官功能改變，影響心臟傳導系統和心肌復極化，引起冠脈痙攣與收縮等而造成心臟缺血、心肌營養不良壞死，導致心肌損傷。因此，本研究以心肌損傷標志物cTnⅠ，氧化應激指標MDA、GSH-Px、SOD，炎性因子TNF-α、NF-κB以及Caspase-3為檢測指標，旨在探討α-硫辛酸發揮缺血再灌注保護效應的作用機制。

本研究結果顯示，實驗組大鼠神經功能評分顯著低于模型組（P<0.05），表明α-硫辛酸對缺血再灌注后的神經具有一定的保護作用。與模型組比較，實驗組大鼠cTnⅠ、MDA及GSH-Px明顯降低，SOD明顯增高（P<0.05），表明α-硫辛酸對缺血再灌注誘發的氧化應激有明顯的抑制作用。實驗組大鼠TNF-α蛋白表達顯著低于模型組（P<0.05），表明α-硫辛酸可能通過抑制TNF-α表達從而抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后的炎癥反應。實驗組大鼠Caspase-3和NF-κB蛋白表達量顯著低于模型組（P<0.05），表明α-硫辛酸可通過抑制Caspase-3和NF-κB蛋白表達抑制遲發性神經元死亡。

綜上所述，α-硫辛酸可改善腦缺血再灌注大鼠神經功能缺損，降低腦缺血再灌注誘導的氧化應激水平，提高腦細胞抗氧化能力，同時抑制Caspase-3介導的細胞調亡，從多途徑發揮腦缺血再灌注保護作用。

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[4]戴炯,文立,熊文浩,等.改良線栓法制備大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型[J].上海交通大學學報:醫學版,2007,27(10):1218-1222.

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Protective effect of α-lipoic Acid on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and its possible mechanism

Meng-min WANG,Zhi TAO,Zhi-hong YANG,Hui-fang LYU
(Department of Pharmacy,Huangpi People's Hospital,Wuhan,Hubei 430300,P.R.China)

【Objective】To observe the protective effect of α-lipoic acid in rat cerebral ischemia and reperfusion on its mechanism of preliminary exploration.【Methods】SD rats were randomly divided into sham operation group, model group and experimental groups of 20,prepared by suture ischemia-reperfusion model,the experimental group was injected intraperitoneally 30min before perfusion α-lipoic acid 20 mg/kg sham group and model group were injected with saline.Observe and compare the two groups of rats neurological function,cardiac injury markers and oxidative stress-related indicators,NF-κB,TNF-α and Caspase-3 expression levels.【Results】The experimental group of neurological scores were significantly lower than the model group(P<0.05),with a statistically significant difference.CTnⅠrats in the experimental group,MDA,GSH-Px were significantly lower than the model group, SOD were significantly higher than the model group(P<0.05),with a statistically significant difference.Experimental group NF-κB,TNF-α and Caspase-3 protein expression was significantly lower than the model group(P<0.05), with a statistically significant difference.【Conclusion】α-lipoic acid may improve cerebral ischemia and reperfusion in rats neurological deficits,reduce cerebral ischemia-reperfusion-induced oxidative stress,and improve the antioxidant capacity of brain cells,while inhibiting Caspase-3-mediated apoptosis from multi-channel play cerebral ischemia and reperfusion.

ischemia-reperfusion;α-lipoic acid;cTnⅠ;MDA;GSH-Px;SOD;NF-κB;TNF-α;Caspase-3

1005-8982（2015）34-0019-04

R743.31

A

2015-06-17

陶智，Tel：18040592217，E-mail：437025192@qq.com