離體心肌細胞損傷模型研究進展

趙 帥，李慶玲，韓 旭，劉小龍，王楚盈，李玉梅，張大方

(長春中醫藥大學研究生院，長春130117)

據世界衛生組織統計，心腦血管疾病已成為威脅人類生命健康的重要因素之一，其發病率仍在逐年攀升，病死率一直位居榜首。隨著科技的進步，大量中外學者對心腦血管疾病的研究不斷細化、深入，由于體內神經和內分泌系統的調節，在體模型很難準確地反映出致病因素對心肌細胞損傷的影響。而體外心肌細胞培養具有條件可控、樣本均一、費用經濟、便于觀察與記錄等優勢［1］，近些年來常被用于藥物或因子對心肌細胞損傷的研究中，填補了在體模型的不足。因此，找到適用于實驗的離體心肌細胞損傷模型至關重要?，F就離體心肌細胞損傷模型簡要論述如下。

1 缺氧復氧損傷模型

心肌細胞缺氧復氧損傷模型是目前離體心肌細胞培養領域應用頻率最高的心肌細胞損傷模型之一。此模型適用于體外模擬臨床治療缺血性心肌病所導致的缺血再灌注的病理損傷。該模型的優勢在于排除體內其他因素干擾，可直觀的觀察條件或藥物對受損心肌細胞的形態、功能、代謝等的影響，更確切的推斷出藥物的作用機制，是篩選臨床抗心肌缺血再灌注損傷藥物的最佳模型。但值得注意的是，單純的缺氧損傷并不等同于臨床上心肌缺血再灌注損傷，還要配合缺糖模型，以模擬心肌缺血的狀態。目前制作缺氧復氧損傷模型分物理、化學兩類方法。

1.1 物理缺氧法 最常見的建立缺氧復氧模型的方法是由WEBESTER K W等［2］改進而來的混合氣體培養法。這種方法用D-Hank's液取代培養液，并將細胞放于密閉容器內通入含95%N2和5%CO2的混合氣體培養來建立缺氧環境，而后用含小牛血清的DMEM替換D-Hank's液，放回含5%CO2的培養箱中復氧。李麗靜等［3］使用無菌自制密閉容器，用Earle's液替換培養液，通入95%N2與5%CO2混合氣體，經2 h缺氧培養后復氧，并對細胞存活率、細胞凋亡率及Beclin-1蛋白表達量進行了檢測，從而證明了參附湯血中移行成分對缺氧復氧損傷的心肌細胞有保護作用。劉哲等［4］使用5%CO2加95%N2混合氣體與無血清低糖DMEM培養液置于培養箱中模擬缺氧環境2 h，再于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液、5%CO2環境中復氧，用于研究西洋參皂苷對缺血再灌注損傷的影響。魏璨等［5］將高純度N2直接通入低糖DMEM培養液中達到飽和，再放入5%CO2培養箱中培養2 h，復氧時直接將缺氧的培養液換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液繼續培養24 h即可。

另有研究者沿襲KOYAMA等［6］方法配制缺氧(缺血)液和復氧(再灌)液以建立缺氧復氧損傷模型［7］。薛 江 波［8］用 NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、Mg-SO4、HEPES、NaCl、KCl、乳酸鈉配制缺氧溶液以置換正常培養液，并于使用前通入N2飽和，從而模擬出缺氧環境。再用 NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgSO4、葡萄糖、HEPES制成復氧溶液，并預先用氧氣飽和，置換出缺氧溶液模擬出復氧環境。

液體石蠟覆蓋避氧法也是常見的建立細胞缺氧復氧模型的物理方法之一。其原理是利用液體石蠟強親脂性隔離細胞與氧氣，達到缺氧效果。吸出石蠟換上正常培養液培養即是復氧。該方法操作簡單安全，但由于液體石蠟不易清洗，標本顯微鏡下觀察易受到石蠟滴的影響［9］。

1.2 化學缺氧法 Na2S2O4、CoCl2及NaN3是常用化學制缺氧方法的試劑。其中Na2S2O4是一種耗氧劑，可以在不損傷細胞的情況下迅速清除培養基中的O2造成缺氧效果，若想復氧，移除現有培養基重新注入正常培養基即可。缺點在于不便于細胞指標的檢測。CoCl2與NaN3則均通過影響與呼吸相關的酶來間接達到細胞缺氧的目的。由于CoCl2所致缺氧原理與臨床心肌缺血存在差異，因此僅應用于研究心肌細胞缺氧狀態下細胞凋亡與保護的調控機制。NaN3可抑制細胞色素C氧化酶，阻礙呼吸鏈反應，但很難恢復受損的細胞活性，適于研究缺氧刺激對心肌細胞的影響，但NaN3的較大毒性使其應用受限［10］。

物理、化學兩類方法各有缺點，物理缺氧法雖較化學缺氧法省時，但難于控制實驗條件、保持缺氧狀態的平衡與維持。化學缺氧法所用化學試劑的劑量及時間難以統一，還易受化學藥物不穩定及濃度等因素影響。因此要根據具體情況選擇適合的造模方法。

2 H2O2損傷模型

H2O2心肌細胞損傷模型與心肌的氧化應激反應相關。H2O2是一種可以對心肌細胞造成損傷的活性氧(ROS)自由基。活性氧是一類在細胞呼吸及代謝過程中產生的氧的單電子還原產物，一方面具有信號轉導和調控細胞活動等生理功能，另一方面過量的產生與堆積會引起生物大分子的過氧化反應，導致細胞結構及功能的破壞，造成細胞壞死或凋亡等不可逆性細胞損傷。臨床上，心肌缺血過程中會發生復雜的氧化應激反應，而氧自由基及其引起的脂質過氧化是造成心肌損傷的啟動因素［11］。因此，H2O2心肌細胞損傷模型常被用于模擬臨床心肌缺血再灌注損傷，或用于研究藥物的抗氧化作用。由此，也有研究者將此模型歸類為缺氧復氧損傷模型的化學方法。

H2O2心肌細胞損傷模型的優勢在于誘導劑經濟易得，操作簡單;但H2O2化學性質活潑，遇堿、遇強光易分解，不易保持模型的穩定。楊翠等［12］用終濃度為100 μmol/L的H2O2建立大鼠乳鼠心肌細胞損傷模型，推斷出人參皂苷Rb1對心肌細胞損傷的保護機制可能與ERK信號通路的激活相關。楊萍等［13］以200 μmol/L 的 H2O2作用乳鼠心肌細胞 2 h造模，證實丹參酮ⅡA可通過增強細胞抗氧化酶活力，抑制H2O2誘導的心肌細胞損傷。

3 阿霉素損傷模型

阿霉素，又名多柔比星，是一種廣譜高效的抗腫瘤藥物。由于阿霉素對心肌的親和力遠高于其他組織，因此用藥時會附帶如心律失常、心力衰竭等明顯的心臟毒副作用。對于阿霉素的致毒機制目前尚沒有形成統一的說法，而廣泛被人們所接受的是自由基理論。其對心肌細胞的損傷與臨床藥源性心肌壞死吻合，有別于正常心力衰竭等病癥所造成的損傷，因此建立阿霉素誘導的心肌細胞損傷模型多適于研究探索既能不降低阿霉素抗腫瘤活性又能對臨床藥源性心肌細胞損傷起到保護作用的藥物。代淵等［14］采用乳鼠心肌細胞培養法，通過MTT法對心肌細胞存活率、Western blot法對NF-κB p65和JNK磷酸化水平的檢測發現，知母寧具有抗阿霉素心肌毒性作用，并由此推斷其保護心肌細胞作用與抑制NF-κB和JNK通路的磷酸化水平具有一定的關聯性。陳莉莉等［15］用濃度為10 μmol/L阿霉素作用24 h建立心肌細胞損傷模型，發現人參皂苷 Rg3可降低 Fas及Bax/Bcl-2mRNA的表達，有利于拮抗化療藥物阿霉素所致大鼠乳鼠心肌細胞損傷。

4 烏頭堿損傷模型

烏頭堿是比較常見的建立心肌細胞心律失常損傷模型的誘導藥物，具有強心作用的同時也可導致心律失常，且有效劑量與中毒劑量相近。所以在使用烏頭堿治療疾病時常配伍其他藥物來減輕其毒性，由此可知，此模型更適用于篩選保護心肌的藥物與抗心律失常藥物。王茁伉等［16］研究發現，濃度為1 μmol/L與2 μmol/L的烏頭堿能明顯促進細胞內Na+含量增加，1.5 μmol/L烏頭堿能明顯抑制細胞Na+-K+-ATP酶活力，有降低細胞Ca2+-ATP酶活力的趨勢，從而驗證了該模型與心律失常發生機制基本一致。王衍堂等［17］通過實驗得出烏頭堿濃度＞1 μg/mL時心肌細胞的存活率顯著且隨濃度升高而降低，MDA含量隨劑量的增加而升高。董晞等［18］通過濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mmol/L 的梯度設計，篩選烏頭堿對心肌細胞作用最佳造模濃度，并驗證出，甘草苷改善了烏頭堿對心肌細胞鉀、鈣離子通道編碼基因的異常表達，從而減輕烏頭堿的毒性作用。

5 AngⅡ損傷模型

AngⅡ具有生長因子樣的作用，是RAAS系統中主要的生物活性物質之一，被認為是導致心肌重構的關鍵因素。在生物體內，腎素－血管緊張素－醛固酮系統(RAAS)可通過AngⅡ與受體結合，多途徑促進血管壁增厚、血管收縮、醛固酮分泌增加、水鈉潴留，誘導胚胎基因表達、心肌細胞肥大及心肌纖維化、成纖維細胞增殖，導致心臟重構。目前AngⅡ與AT1受體結合模型已接近成熟，并被廣泛應用于誘導建立體外乳鼠心及細胞肥大模型。但AngⅡ價格略顯昂貴。楊雷［19］、毛秉豫［20］等通過光鏡下對細胞直徑的觀察，確立了濃度為10－6g/L的AngⅡ誘導心肌肥大模型的成立，并檢測了心肌細胞蛋白質含量與PKD1 mRNA的表達，得出結論，中藥提取物可通過下調PKD1 mRNA的表達而抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大。陳建康等［21］用濃度為10－6mol/L的AngⅡ造模，證明吡哆胺和替米沙坦均可改善氧化應激，協同下調大鼠心肌細胞RAGE mRNA的表達，且吡哆胺較替米沙坦作用更強。

6 異丙腎上腺素損傷模型

近年研究表明，心臟局部的生物活性物質如AngⅡ、兒茶酚胺類、胰島素樣生長因子、一氧化氮等在心肌肥大的產生中扮演著重要的角色。異丙腎上腺素屬于人工合成的兒茶酚胺類藥物，可以促使心肌細胞鈣超載，心率收縮力增強，氧自由基損傷，導致心肌缺血。此模型表現與臨床擴張型心肌病、缺血性心臟病相似，常被應用于體內或體外建立心肌細胞肥厚模型。

楊娟等［22］以10 μmol/L濃度的異丙腎上腺素建立出生乳鼠心肌細胞肥大模型，通過RT-PCR法與Western blotting法檢測，發現黃芪甲苷對異丙腎上腺素誘導的心肌細胞肥大的抑制可能與TLR4/NF-κB信號通路有關。高杉等［23］通過實驗證明，濃度為10－5mol/L的異丙腎上腺素能明顯誘導心肌細胞肥大，并證明低聚葡萄籽原花青素可劑量依賴性地抑制該模型下的細胞內氧自由基生成，降低MDA含量，提高SOD活性，從而達到抑制心肌細胞肥大的作用。

7 結語

離體心肌細胞培養能最大限度的克服實驗動物的個體差異，并保留細胞完善的生理功能及電生理特性，排除了機體通過神經體液及激素對實驗結果的干擾，使細胞代謝相較于在體實驗更加穩定，但也造成其不能真實代表細胞來源的組織，是離體細胞培養的弊端所在。另外，離體細胞培養實驗相較于在體實驗成本低、周期短、操作簡單，在藥物篩選、研發和機制研究中可以廣泛應用。但任何一種模型都無法完全模擬出臨床上心血管疾病復雜的病理變化，因此研究者需要根據實驗目的，選擇致病機制相近的模型，并結合在體實驗綜合分析才能得到更完善、真實的實驗結論。

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