丙酮酸乙酯對腦出血大鼠血清腫瘤壞死因子α和白介素6水平的影響

鄧 楠，楊光偉，李小剛

·論著·

丙酮酸乙酯對腦出血大鼠血清腫瘤壞死因子α和白介素6水平的影響

鄧 楠，楊光偉，李小剛

目的 探討丙酮酸乙酯對腦出血大鼠血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)水平的影響。方法 采用自體動脈血制備腦出血模型，將48只清潔級SD大鼠隨機分為假手術組(F組，n=8)、腦出血組(ICH組，n=20)和丙酮酸乙酯干預組(EP組，n=20)。F組大鼠只進針，不注血；ICH組大鼠建立腦出血模型后腹腔注射0.9%氯化鈉溶液；EP組大鼠建立腦出血模型后腹腔注射丙酮酸乙酯，每組大鼠按建模時間(6 h、24 h、3 d、7 d)不同分為4個亞組。評估各組大鼠不同建模時間點神經功能缺損程度，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測大鼠不同建模時間點血清TNF-α、IL-6水平。結果 ICH組不同建模時間點神經功能缺損評分低于EP組，EP組低于F組(P<0.05)。ICH組大鼠不同建模時間點血清TNF-α水平高于F組和EP組，ICH組和EP組大鼠不同建模時間點血清IL-6水平高于F組，除建模24 h 外ICH組大鼠血清IL-6水平均高于EP組(P<0.05)。結論 腦出血后大鼠神經功能受損，血清TNF-α、IL-6等炎性因子水平升高。丙酮酸乙酯能降低血清TNF-α、IL-6等炎性因子水平，抑制炎性反應，對腦出血大鼠具有腦保護作用。

腦出血；丙酮酸乙酯；腫瘤壞死因子α；白介素6；大鼠

腦出血是一種常見的腦血管疾病，其發病率和致殘、致死率均高。大量研究表明，腦出血后炎性細胞趨化于血腫周圍并釋放炎性因子[1]，從而誘導腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)等炎性因子的表達，參與腦水腫、炎性反應等引起繼發性腦損害[2]。丙酮酸乙酯可以通過減少TNF-α和IL-6的表達而減輕炎性反應和缺血再灌注引起的器官損傷[3]，從而實現腦保護作用。目前，關于丙酮酸乙酯對腦出血后血清炎性因子影響的相關研究尚少，本實驗通過檢測大鼠腦出血后不同時間點血清炎性因子TNF-α、IL-6的表達情況，探討丙酮酸乙酯對腦出血大鼠血清炎性因子TNF-α和IL-6水平的影響，以闡述丙酮酸乙酯對腦出血大鼠的腦損傷保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠48只，成年雄性，體質量300～350 g，由瀘州醫學院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 丙酮酸乙酯(98%)(美國Sigma公司)用Ringer′s液配制濃度為1 mg/ml，TNF-α酶聯免疫試劑盒(上海西塘)，IL-6酶聯免疫試劑盒(上海西塘)，低溫離心機(上海安亭科學儀器廠)，MK3酶標儀(德國Thermo公司)，MK2洗板機(德國Thermo公司)，數字顯示隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)，漩渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)，眼科手術器械一套，腦立體定位儀，分光光度儀。

1.3 實驗分組 采用隨機數字表法將SD大鼠分為3組。(1)假手術組(F組)(n=8)：只進針，不注血。(2)腦出血組(ICH組)(n=20)：建立腦出血模型后2 h腹腔注射0.9%氯化鈉溶液(40 mg/kg)，之后1次/d，至動物被處死。(3)丙酮酸乙酯干預組(EP組)(n=20)：建立腦出血模型后2 h腹腔注射丙酮酸乙酯(40 mg/kg)，之后1次/d，至動物被處死。每組按建模時間(6 h、24 h、3 d、7 d)不同分為4個亞組。

1.4 腦出血模型制備 參照文獻[4]方法建立腦出血模型，將1%戊巴比妥鈉按0.4 ml/100 g劑量進行腹腔注射，取大鼠自體動脈血后將其固定于立體定向儀上，微量進針器沿進針點垂直進針6 mm，達到大腦尾狀核后將血液緩慢注入大鼠顱內，假手術組方法同前，但只進針，不注血。

1.5 神經功能缺損評分 處理后大鼠在各亞組相應時間點采用Garcia等[5]制定的評分法進行神經功能缺損評分，最高分18分，最低分3分，分數越低神經功能缺損程度越嚴重。

1.6 標本的采集與檢測 取大鼠腔靜脈血4 ml，離心(3 000 r/min)10 min后吸取上清液保存于-20 ℃冰箱。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測大鼠血清TNF-α、IL-6水平，具體操作步驟嚴格按說明書進行。

2 結果

2.1 3組大鼠不同建模時間點神經功能缺損評分比較 3組大鼠建模6 h、24 h、3 d、7 d神經功能缺損評分比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中ICH組不同建模時間點神經功能缺損評分低于EP組，EP組低于F組，差異有統計學意義(P<0.05)。ICH組大鼠建模3 d神經功能缺損評分低于其他建模時間點，差異有統計學意義(P<0.05，見表1、圖1)。

Table 1 Comparison of neural function defect score among 3 groups of rat at different modeling time points

組別只數6h24h3d7dF組214 5±0 715 5±0 716 0±0 015 5±0 7ICH組57 4±0 9?7 2±0 8?6 0±1 0?★7 6±0 9?EP組59 8±0 8?▲10 4±0 5?▲11 4±0 7?▲9 8±0 8?▲F值51 81111 57121 9063 79P值0 000 000 000 00

注：與F組比較，*P<0.05；與ICH組比較，▲P<0.05；與同組其他時間點比較，★P<0.05。F組=假手術組，ICH組=腦出血組，EP組=丙酮酸乙酯干預組

注：F組=假手術組，ICH組=腦出血組，EP組=丙酮酸乙酯干預組

圖1 3組大鼠不同建模時間點神經功能缺損評分比較

Figure 1 Comparison of neural function defect score among 3 groups of rat at different modeling time points

2.2 3組大鼠不同建模時間點血清TNF-α水平比較 3組大鼠建模6 h、24 h、3 d、7 d血清TNF-α水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中ICH組大鼠不同建模時間點血清TNF-α水平高于F組和EP組，差異有統計學意義(P<0.05)。ICH組大鼠建模3 d血清TNF-α水平高于其他建模時間點，差異有統計學意義(P<0.05，見表2、圖2)。

2.3 3組大鼠不同建模時間點血清IL-6水平比較 3組大鼠建模6 h、24 h、3 d、7 d血清IL-6水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中ICH組和EP組大鼠不同建模時間點血清IL-6水平高于F組，除建模24 h 外ICH組大鼠血清IL-6水平均高于EP組，差異有統計學意義(P<0.05)。ICH組大鼠建模3 d血清IL-6水平高于其他建模時間點，差異有統計學意義(P<0.05，見表3、圖3)。

Table 2 Comparison of serum TNF-α level among 3 groups of rat at different modeling time points

組別只數6h24h3d7dF組257 07±6 6731 65±2 6438 70±2 8545 95±3 40ICH組5136 09±14 19?201 29±23 03?253 08±16 61?★219 81±45 17?EP組569 28±7 04▲135 97±17 27?▲50 18±5 53▲56 20±11 15▲F值62 8056 82452 8342 06P值0 000 000 000 00

注：與F組比較，*P<0.05；與ICH組比較，▲P<0.05；與同組其他時間點比較，★P<0.05

圖2 3組大鼠不同建模時間點血清TNF-α水平比較

Figure 2 Coparison of serum TNF-α level among 3 groups of rat at different modeling time points

Table 3 Comparison of serum IL-6 level among 3 groups of rat at different modeling time points

組別只數6h24h3d7dF組227 26±1 2419 03±2 6133 80±2 6018 89±1 46ICH組580 83±6 12?162 15±17 34?191 21±21 66?★171 11±20 79?EP組564 38±7 55?▲126 68±18 81?78 85±7 16?▲44 17±5 84?▲F值48 6150 31104 81128 71P值0 000 000 000 00

注：與F組比較，*P<0.05；與ICH組比較，▲P<0.05；與同組其他時間點比較，★P<0.05

圖3 3組大鼠不同建模時間點血清IL-6水平比較

Figure 3 Comparison of serum IL-6 level among 3 groups of rat at different modeling time points

3 討論

腦出血是一種常見的腦血管疾病，其發病率和致殘、致死率均較高。腦損傷包括血腫占位效應及腦水腫、血-腦脊液屏障破壞、細胞凋亡[6]、細胞興奮性損害等，其中炎性因子貫穿于腦損傷與修復的整個過程，被認為與神經元損傷、預后有密切關系。研究發現，腦出血后小膠質、巨噬細胞、白細胞等炎性細胞迅速浸潤到出血組織中參與血腫清除，而另一方面過度活化的炎性細胞大量釋放氧自由基、一氧化氮(NO)、炎性因子等參與免疫炎性反應，增加血-腦脊液屏障通透性，導致腦損傷和神經元凋亡[7]。張健等[8]研究認為，血清TNF-α、IL-6水平與腦出血嚴重程度呈正相關，其水平持續升高提示患者預后差。IL-6由膠質細胞、淋巴細胞、血管內皮細胞等多種細胞產生，在中樞神經系統中發揮神經保護及神經毒性雙重作用，低水平IL-6具有促進神經分化與修復的作用，而高水平IL-6則具有損傷神經的作用[9]。周洪霞等[10]在大鼠腦出血的血腫周圍腦組織內檢測到高水平IL-6，其水平與腦水腫變化趨勢一致，因此認為IL-6參與腦水腫的形成。TNF-α是一種多功能的促炎性細胞因子，具有多種生物活性，能廣泛參與炎性反應及免疫調節，腦出血后其可迅速被炎性細胞激活[11]，通過改變血-腦脊液屏障和誘導趨化因子的表達而加重腦組織炎癥，還能誘導星形膠質細胞分泌谷氨酸參與細胞毒性作用[12]。Manye等[13]研究發現，TNF-α能促進腦出血血腫周圍炎性反應，引起腦出血后繼發性腦損傷。

既往丙酮酸乙酯常用于治療心肌梗死、急性胰腺炎、休克、燒傷、急性顱腦損傷、缺血再灌注損傷等，具有抗感染、清除自由基、保護心肌、降低膽固醇等作用[14]。曾漣等[15]在膿毒血癥大鼠模型研究中發現，丙酮酸乙酯能減少血清中炎性因子如TNF-α、IL-6等水平、減輕器官功能損害。丙酮酸乙酯中的丙酮酸(CH3COCOOH)能穿透血-腦脊液屏障進入腦內發揮腦保護作用[16]。研究發現，丙酮酸乙酯能抑制由中性粒細胞激活釋放的炎性因子(如TNF-α、IL-6等)及黏附因子的表達，通過抑制TNF的釋放及活性而達到減輕腦內炎性損傷、保護腦組織的作用[17]。

本研究結果表明，大鼠腦出血后神經功能缺損評分下降，血清TNF-α、IL-6水平升高，提示腦出血后存在炎性反應。ICH組大鼠建模6 h血清TNF-α、IL-6水平開始上升，于建模3 d達到高峰，且其水平高于F組和EP組。這與國內外相關實驗報道相符合，進一步證實了腦出血后炎性反應對腦組織的損傷。經丙酮酸乙酯治療的腦出血大鼠不同建模時間點神經功能缺損評分高于ICH組，血清TNF-α、IL-6水平低于ICH組，表明丙酮酸乙酯有助于恢復腦出血大鼠的神經功能，其作用機制可能與減少炎性因子、減輕氧化應激反應有關。

綜上所述，丙酮酸乙酯能保護腦出血大鼠神經元、改善神經功能、抑制炎性反應，為臨床治療腦出血提供新的思路，但藥物治療劑量、治療時間窗及藥物不良反應仍有待進一步研究。

[1]張祥建，劉春燕，祝春華.大鼠自體動脈血腦出血動物模型的建立[J].腦與神經疾病雜志，2003，11(6)：341-344.

[2]Garcia JH，Wagner S，Liu KF，et al.Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rat statistical validation[J].1995，26(4)：627-635.

[3]Hickenbottom S，Hua X.NF-KB and neuronal cell death after experimental intracerebral hemorrhage[J].Stroke，2006，30(11)：2472-2477.

[4]潘新發，萬曙，詹仁雅.腦出血后血腫周圍組織炎癥反應的研究進展[J].國際神經病學神經外科學雜志，2010，37(3)：263-267.

[5]Sappington PL，Han X，Yang R，et al.Ethyl pyruvate ameliorates intestinal epithelial barrier dysfunction in endotoxemic mice and immunostimulated caco-2 enterocytic monolayers[J].J Pharmacol Exp Ther,2003，304(1)：464-476.

[6]Aronowski J， Hall CE.New horizons for primary intracerebral hemorrhage treatment：Experience from preclinical studies[J].Neurol Res，2005，27(3)：268-279.

[7]劉曉靜，張擁波，李繼梅.炎癥在腦出血后腦損傷及其治療中的作用[J].臨床和實驗醫學雜志，2013，12(1)：70-75.

[8]張健，陳干逃.急性腦出血患者IL-6和TNF-α水平與預后的關系[J].實用癌癥雜志，2012，27(6)：652，657.

[9]劉振華，仉烈煒，杜怡峰，等.炎性因子在出血后繼發性腦損傷中的作用機制研究進展[J].山東醫藥，2012，52(46)：95-96.

[10]周洪霞，婁寧，魏子峰，等.大鼠腦出血后血腫周圍腦水腫及其與NF-kB和IL-6表達的關系[J].山東大學學報：醫學版，2012，50(11)：30-33.

[11]管棟.小膠質細胞激活與腦出血后繼發性腦損傷機制的研究進展[J].國際神經病學神經外科學雜志，2012，39(4)： 383-386.

[12]Bezzi P，Domercq M，Brambilla L，et al.CXCR4-activitied astrocyte glutamate release via TNFalpha：amplification by microglia triggers neurotoxicity[J].Nat Neurosci，2001，4(7)：702-710.

[13]Mayne M，Ni W，Yan HJ，et al.Antisense oligodeoxynucleotide inhibition of tumor necrosis factor-αlpha expression is neurprotective after intracerebral hemorrhage[J].Stroke，2011，32(1)：240-248.

[14]趙喜紅，何小維，李彥萍.丙酮酸鹽的生理功效及其應用研究進展[J].釀酒科技，2007(2)：80-83.

[15]曾漣，姚尚龍，劉東.丙酮酸乙酯對大鼠膿毒癥肺損傷的保護作用[J].中國急救醫學，2005，25(10)：725-727.

[16]Miller LP，Oldendorf WH.Regional kinetic constants for blood-brain barrier pyruvic acid transport in conscious rats by the monocarboxylic acid carrier[J].Neurochem，1986，46(6)：1412-1416.

[17]田培超，喬曉輝，羅強.丙酮酸乙酯對內毒素致幼鼠感染性腦損傷的保護作用[J].實用兒科臨床雜志，2008，23(16)：1270-1271.

(本文編輯：謝武英)

Influence of Ethyl Pyruvate on Serum Levels of TNF-α and IL-6 in Rats with Cerebral Hemorrhage

DENGNan，YANGGuang-wei，LIXiao-gang.DepartmentofNeurology，People′sHospitalofLuzhou，Luzhou646000，China

Objective To investigate the influence of ethyl pyruvate on serum levels of TNF-α and IL-6 in rats with cerebral hemorrhage.Methods A total of 48 specific pathogen free Sprague-Dawley rats were selected and randomly divided into groups A(n=8)，B(n=20)，C(n=20).A group was given sham-operation，B group was given autologous arterial blood to build cerebral hemorrhage model and then given intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride solution，C group was given autologous arterial blood to build cerebral hemorrhage model and then was given intraperitoneal injection of ethyl pyruvate.After 6 hours，24 hours，3 days，7 days of intervention，2，5，5 rats were randomly picked out from groups A，B，C，respectively，and the degree of nervous functional defects was evaluated，ELISA to used to detect the serum levels of TNF-α and IL-6.Results The nervous functional defects score of B group was lower than that of C group at each time point，respectively，and that of C group was lower than that of A group，respectively(P<0.05).The serum TNF-α level of B group was higher than that of groups A and C at each time point，respectively；the serum IL-6 level of groups B and C was higher than that of A group at each point，respectively，and serum IL-6 level of B group was higher than that of C group after 6 hours，3 days，7 days of intervention.Conclusion Rats with cerebral hemorrhage have different degrees of nervous functional defects，and the serum levels of TNF-α and IL-6 are higher；ethyl pyruvate can reduce the serum levels of TNF-α and IL-6，inhibit the inflammatory reactions，has some cerebral protection effect.

Cerebral hemorrhage；Ethyl pyruvate;Tumor necrosis factor-alpha；Interleukin-6；Rats

646000四川省瀘州市人民醫院神經內科(鄧楠)；瀘州醫學院附屬醫院神經外科(楊光偉)，神經內科(李小剛)

鄧楠，楊光偉，李小剛.丙酮酸乙酯對腦出血大鼠血清腫瘤壞死因子α和白介素6水平的影響[J].實用心腦肺血管病雜志，2015，23(2)：49-52.[www.syxnf.net]

R 743.34

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.02.015

2014-08-16；

2015-01-23)

Deng N，Yang GW，Li XG.Influence of ethyl pyruvate on serum levels of TNF-α and IL-6 in rats with cerebral hemorrhage[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(2)：49-52.