護肝片對小鼠肝纖維化模型中SOD和MDA的影響

白 劍，肖 漓，韓 永，畢麗麗，張麗萍，王學良，石炳毅*

護肝片對小鼠肝纖維化模型中SOD和MDA的影響

白 劍1,2，肖 漓1，韓 永1，畢麗麗1，張麗萍2，王學良2，石炳毅1*

目的 觀察護肝片對四氯化碳(CCl4)誘導的小鼠肝纖維化模型血清中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的影響。方法 將30只雄性SPF級C57B/L小鼠隨機分為空白對照組、模型組、護肝片組，每組10只。空白對照組給予100%花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；模型組給予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；護肝片組給予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周，并從第3周起給予護肝片1 g/(kg·d)灌胃至第10周。第10周，通過摘除眼球取血，檢測小鼠血清中的透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)的含量；檢測肝臟組織中SOD和MDA的含量；計算肝臟指數；HE染色觀察小鼠肝臟的病理組織學改變。結果 與空白對照組比較，模型組小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST水平升高(P<0.05)，肝臟組織中SOD降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)，肝臟指數增加(P<0.05)，病理檢查顯示肝細胞壞死并出現脂肪空泡、纖維組織增生和炎細胞浸潤；與模型組比較，護肝片組小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT 和AST的水平降低(P<0.05)，肝臟組織中SOD水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)，肝臟指數降低(P<0.05)，病理檢查顯示肝臟組織中無炎性細胞浸潤、脂肪空泡和纖維組織沉積。結論 護肝片可以降低肝纖維化小鼠肝組織中MDA的含量，提高SOD含量，實現對纖維化肝臟的保護作用。

護肝片；肝纖維化；SOD；MDA

0 引言

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病發展到一定階段的共同特征，從病理學角度上看，肝纖維化是肝細胞基質(Extra-cellular matrix，ECM)代謝異常，表現為ECM的合成增多而分解減少，最終導致其大量沉積的過程[1]。ECM主要是肝星狀細胞(Hepatocyte stellate cell，HSC)活化后，由HSC異常分泌所致，而HSC異常活化和增生與肝細胞的免疫功能異常有關[2-3]。目前西醫治療肝纖維化尚無特效方法，在代償期主要以護理為主；失代償期主要采用支持療法以控制疾病發展速度。抗肝纖維化的西藥如秋水仙堿、青霉胺等，動物實驗顯示其可在一定程度上改善肝纖維化癥狀，但在臨床應用中療效并不理想，而且不良反應較多[4]。護肝片是由柴胡、茵陳、板藍根、五味子等多味中藥制成的復方制劑，也是國家中藥保護品種之一。護肝片具有清熱解毒、活血化瘀、改善免疫等功能，對于各種類型原因導致的肝纖維化均有一定的治療作用[5-6]。本實驗在此基礎上，通過分析護肝片對CCl4所致小鼠肝纖維模型中小鼠血液生化指標和肝臟內SOD、MDA含量的影響，探討護肝片對肝纖維化小鼠模型的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要儀器 C57B/L小鼠30只，體重(20±1) g，4～5周齡，由遼寧長生生物技術有限公司提供；TBA-40FR全自動生化檢測儀購自日本東芝公司；721分光光度計購自上海精密科學儀器廠。

1.2 試劑 水合氯醛、CCl4分析純均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；魯花牌花生油；HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C 試劑盒購自上海研晶生物科技有限公司；ALT、AST檢測試劑購于四川邁克生物科技有限公司；SOD、MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；護肝片購自黑龍江葵花藥業股份有限公司。

1.3 實驗分組和動物模型的制備 30只SPF級C57B/L雄性小鼠隨機為空白對照組、模型組和護肝片組，每組10只。空白對照組給予100%花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；模型組給予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；護肝片組給予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周，并從第3周起給予護肝片1 g/(kg·d)灌胃至第10周。

1.4 組織采樣 在第10周通過摘除眼球取血，檢測小鼠血清中的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST的含量；計算肝臟指數，檢測肝臟組織中SOD和MDA的含量；將剩余肝臟組織浸泡于5%的福爾馬林溶液中固定，使用HE染色觀察小鼠肝臟的病理組織學改變。

2 結果

2.1 護肝片對CCl4肝纖維化小鼠肝臟指數的影響 通過稱量小鼠及其肝臟的重量，按照公式計算：肝臟指數=肝臟的重量/小鼠的重量。結果顯示，模型組與其他兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組小鼠肝臟指數比較

注：與模型組比較，*P<0.05

2.2 護肝片對CCl4肝纖維化小鼠肝功能指標的影響 三組小鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT、AST含量比較見表2。結果顯示，小鼠經CCl4腹腔注射后，血清中的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT、AST含量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，提示肝細胞受損，在經過護肝片治療后，各組相關指標明顯下降。

表2 三組小鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT、AST比較

注：與模型組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05

2.3 護肝片對小鼠肝組織內SOD和MDA的影響 小鼠經CCI4腹腔注射后，血清中的SOD水平明顯升高，MDA的含量明顯降低，提示肝細胞受損，在經過護肝片治療后，各組相關指標升高。見表3。

表3 護肝片對小鼠肝組織脂質過氧化損傷的影響

注：與模型組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05

2.4 護肝片對CCl4肝纖維化小鼠肝臟病理變化的影響 見圖1。空白對照組小鼠肝細胞體積較大，呈多面體形，核大而圓，核膜完整，位于細胞中央；肝細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，板間為不規則的肝竇；肝細胞間連接緊密(圖1A)。模型組小鼠肝小葉界限不清，胞質內還可見多個大小不等的脂肪空泡；出現炎性細胞浸潤；肝細胞索排列紊亂；肝竇變窄(圖1B)。護肝片處理組肝組織結構有較明顯改善，肝細胞脂肪變性顯著減輕，未見炎性細胞浸潤與假小葉形成(圖1C)。

圖1 三組小鼠肝切片比較(×200)

3 討論

肝纖維化(Hepatic fibrosis)是由于肝炎病毒、酒精、藥物、毒物、血吸蟲等多種損傷因素長期刺激肝臟造成的一種常見慢性肝臟疾病，往往是導致肝硬化或肝癌發生的重要始動因素[7-8]。肝纖維化的病因復雜，包括飲食原因引起的肝纖維化(酒精性和高脂高熱量性肝纖維化)、先天代謝性肝纖維化(肝豆狀核變性)、感染性肝纖維化(病毒性肝炎)、腫瘤性肝纖維化、基因缺陷性肝纖維化、自身免疫性肝纖維化、化學藥物性肝纖維化和先天性肝臟畸形肝纖維化等[9]。目前肝硬化模型的建立方法很多，本次實驗采用較為穩定的CCl4造模方式，這種方法時間短、簡便、成功率高且穩定。CCl4在肝細胞的滑面內質網內可分解為·CCl3和Cl，其中·CCl3可通過共用電子對和細胞色素P450酶的磷脂部分結合，使得細胞色素P450 2E1酶(CYP2E1)活性升高，產生大量活性氧簇(ROS)和RNS[10]，造成肝臟的損傷并最終形成肝纖維化。

中醫學認為肝纖維化屬于“瘤”、“痹”、“痞”、“積”等范疇，痰瘀互結致使全身氣、血、津液運行不暢，陰陽失調，嚴重時導致肝硬化[11]。護肝片的組方來源于漢代《傷寒論》中的小柴胡湯合茵陳蒿湯加減[12]，由柴胡、茵陳、板藍根、五味子、豬膽粉、綠豆組成。其中，柴胡中的柴胡皂苷能降低血脂，抑制肝臟脂肪性變；五味子能提高肝細胞活性，增強肝臟功能；茵陳中的茵陳膽堿可將肝臟內脂肪轉化為磷脂，從肝臟中運出，使脂肪不能在肝臟中沉積；豬膽汁粉能顯著改善脂肪肝患者的消化道癥狀。可見護肝片可以從多個方面改善全身氣、血、津液運行不暢的癥狀，對肝纖維化有明確的治療作用。

本研究結果表明，護肝片可以明顯改善CCl4肝纖維化模型小鼠血清中肝纖維化、肝功能指標，并使小鼠肝臟的炎性浸潤和脂肪空泡消失、匯管區無纖維素沉積，具有明顯的保肝作用。MDA是氧化應激常用的標志物，由多不飽和脂肪酸過氧化分解產生，是細胞膜脂質過氧化的終產物之一，可間接反映機體的自由基代謝變化及細胞的損傷程度[13]。護肝片能夠顯著降低肝臟組織中的MDA水平，減輕過氧化反應，減輕MDA對機體的損傷。SOD廣泛存在于需氧有機體中，是一種抗氧化的酶。機體內SOD和MDA的水平能夠反映機體清除自由基的能力和受到自由基損傷的程度。本研究中，小鼠經護肝片治療8周后，肝臟組織SOD水平顯著提高，使細胞中有足夠的SOD對抗過氧化反應，清除氧自由基，保護細胞膜免受自由基的攻擊，最終實現對肝臟的保護作用。

綜上所述，護肝片對于肝纖維化疾病有良好且確切的治療效果。除了具有疏肝健脾的功效之外，護肝片還可以降低MDA在肝組織內的含量，同時提升SOD水平使細胞中有足夠的SOD清除氧自由基，從多方面保護受損肝臟，可作為肝纖維化疾病的臨床常規用藥加以推廣。

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Effect of liver-protecting tablets on the expression of SOD and MDA in mice with carbon tetrachloride induced liver fibrosis

BAI Jian1,2,XIAO Li1,HAN Yong1,BI Li-li1,ZHANG Li-ping2,WANG Xue-liang2,SHI Bing-yi1*

(1.Institute of Organ Transplantation,The 309th Hospital of Chinese PLA,Beijng 100091,China;2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China)

Objective To observe the effect of liver-protecting tablets on the expression of super oxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in mice with carbon tetrachloride induced liver fibrosis.Methods Thirty male SPF class C57B/L mice were randomly divided into three groups: control group,model group,liver-protecting tablets group.Mice in control group (n=10) were intraperitoneally injected 100% peanut oil 1 mL/kg,twice a week in total 10 weeks;mice in model group (n=10) were intraperitoneally injected peanut oil containing 20% carbon tetrachloride 1 mL/kg,twice a week in total 10 weeks;mice in liver-protecting tablets group (n=10) were intraperitoneally injected peanut oil containing 20% carbon tetrachloride 1 mL/kg,twice a week in total 10 weeks,and liver-protecting tablet 1 g/(kg·d) was used from the third week to the tenth week.At the tenth week,the blood samples were collected from the mice by removing eyes,the content of hyaluronic acid (HA),layer adhesion protein (LN),collagen type former Ⅲ (PCⅢ),collagen-Ⅳ (Ⅳ-C),alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in serum were tested.The contents of SOD and MDA in liver tissue were tested;liver index was calculated;pathological and histological changes of mice liver were observed by HE staining.Results Compared with control group,the serum HA,LN,PC Ⅲ,Ⅳ-C,ALT and AST of mice in model group increased more significantly (P<0.05),SOD in liver tissue was lower (P<0.05),MDA in liver tissue was higher (P<0.05),liver index increased (P<0.05),pathological examination showed that there were necrosis in liver cells,fat vacuoles,fibrous tissue hyperplasia and inflammatory cell infiltration in model group.Compared with model group,the serum HA,LN,PC Ⅲ,Ⅳ-C,ALT and AST of mice in liver-protecting tablets group significantly reduced (P<0.05),SOD in liver tissue was higher (P<0.05),MDA in liver tissue was lower (P<0.05),liver index significantly decreased (P<0.05),pathological examination showed that there was no inflammatory infiltration,fat vacuoles and fibrous tissue deposition in liver tissue.Conclusion Liver-protecting tablets can decrease the content of MDA and increase the content of SOD in liver tissue,relieve the liver fibrosis of mice induced by carbon tetrachloride.

Liver-protecting tablets;Liver fibrosis;SOD;MDA

2015-01-14

1.中國人民解放軍第三〇九醫院器官移植研究所，北京 100091；2.遼寧中醫藥大學，沈陽 110847

遼寧省自然科學基金(201101142)；遼寧省社會發展攻關計劃(2012225018)

10.14053/j.cnki.ppcr.201508008

*通信作者