Rho激酶介導醛固酮致人近端腎小管上皮細胞間充質轉分化

孫廣萍，朱 凱,李德天*

Rho激酶介導醛固酮致人近端腎小管上皮細胞間充質轉分化

孫廣萍1，朱 凱2,李德天1*

目的 探討醛固酮(Aldosterone,ALD)能否誘導人近端腎小管上皮細胞(HK2細胞)發生上皮間充質轉分化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及Rho激酶在此過程中的作用。方法 用無血清DMEM/F-12培養液同步化培養HK2細胞24 h后,將HK2細胞分為對照組、ALD組、ALD+螺內酯(鹽皮質激素受體拮抗劑)組，ALD+Y-27632(Rho激酶抑制劑)組，觀察各組間E-cadherin、α-SMA 蛋白(Western blot法)及mRNA(real-time PCR法)表達，以及各組間磷酸化MYPT-1的表達(Western blot法)。結果 終濃度為10-7M的ALD作用下，隨作用時間延長，HK2細胞 E-cadherin蛋白及mRNA表達逐漸減少，α-SMA蛋白及mRNA表達逐漸增多，提示HK2細胞發生了EMT。與對照組相比，ALD組E-cadherin蛋白及mRNA表達明顯減少(P<0.05)，α-SMA蛋白及mRNA表達顯著增多(P<0.05)，伴有磷酸化MYPT-1表達增多；而螺內酯及Y-27632均明顯減輕了上述改變，與醛固酮組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 Rho激酶活化介導了醛固酮誘導的HK2細胞發生EMT。

醛固酮；EMT；Rho激酶；HK2細胞

0 引言

腎小管間質纖維化是腎功能進行性進展至終末期腎病的共同途徑，其比腎小球病變更易引起腎功能進展亦成為共識。近年來研究認為，多種因素可以誘導腎小管上皮細胞發生上皮間充質轉分化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)[1]，使腎小管上皮細胞首先轉變為肌成纖維細胞，再轉變為纖維細胞，是促進腎間質纖維化的重要途徑之一。

通常情況下，醛固酮(ALD)作為鹽皮質激素調節機體的水鹽代謝。但近年來發現，ALD有促進器官纖維化的作用，除心臟、血管、腦外，在腎臟的系膜細胞、足細胞、腎小管上皮細胞以及間質成纖維細胞上都存在鹽皮質激素受體(Mineralosteroid receptor,MR)[2]。在ALD灌注大鼠[3]，不僅存在嚴重的腎小球損傷，還表現明顯的腎小管間質纖維化，伴隨有腎小管上皮細胞表達α-SMA增多，表明ALD可能有誘導腎小管上皮細胞發生EMT的作用。

Rho激酶是小G蛋白Rho的一個效應因子，激活后調節肌動、肌球蛋白交聯增加，促進應力纖維和粘附斑的形成，調節肌動蛋白細胞骨架的聚合，從而介導包括平滑肌收縮、細胞與基質及細胞與細胞間粘附、細胞遷移、增生、分化等與腎臟損傷相關的細胞功能[4-5]。近年來許多體內體外研究提示，Rho/Rho激酶通路參與調節腎小管上皮細胞發生EMT，從而引起腎間質纖維化[6-7]。

筆者研究發現，在ALD作用下，大鼠出現大量蛋白尿及腎臟纖維化的同時，伴有Rho激酶活性增強，腎小管上皮細胞表達α-SMA增多，應用Rho激酶抑制劑fasudil抑制Rho激酶活性，雖無明顯降壓作用，卻明顯減輕了腎間質纖維化，腎小管上皮細胞表達α-SMA減少，提示ALD可能通過激活Rho激酶誘導腎小管上皮細胞發生EMT[3]。本研究旨在利用人近端腎小管上皮細胞HK2細胞系，體外予ALD刺激，探討ALD能否通過Rho激酶途徑誘導腎小管上皮細胞發生EMT。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 人HK2細胞系 購于美國ATCC細胞平臺，在6孔板上接種HK2細胞，用10% FBS的DMEM/F-12培養液、置CO2培養箱(5% CO2,37 ℃)培養，待細胞生長達到70%融合，換用無血清DMEM/F-12培養液，置5%CO2培養箱中培養。靜置24 h后細胞同步化進行條件干預。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F-12培養液、小牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶購于美國Hyclone 公司,ALD粉劑(Sigma)、螺內酯(Spirolactone,Spi)購于Sigma；Y-27632(RB)，兔抗人E-cadherin抗體，鼠抗人α-SMA抗體，鼠抗人GAPDH抗體購自北京中杉生物技術有限公司；鼠抗人磷酸化MTYPT-1抗體(Santa Cruz)。RIPA全蛋白裂解液購自碧云天公司，磷酸化/去磷酸化保護劑購自凱基公司。TRIzol購自美國Invitrogen公司，E-cadherin、α-SMA及GAPTH引物由美國Invitrogen公司合成；逆轉錄試劑盒及定量試劑盒購自日本 TAKARA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞處理 將5～6代的HK2傳代于6孔細胞培養板中培養，待細胞融合率達70%，換無血清DMEM/F-12培養液培養24 h,加入終濃度為10-7M的ALD，檢測不同時間點(0、12、24、48 h)HK2細胞α-SMA、E-cadherin蛋白及mRNA表達。

1.2.2 細胞分組 對照組(C組)：無血清 DMEM/F-12 培養液。ALD組：ALD 終濃度10-7M。Spi組：在ALD干預前，螺內酯預孵6 h，終濃度10-7M。Y-27632組：在ALD干預前，Y-27632預孵1 h，終濃度10-6M。各組均設3復孔。

1.2.3 Western blot法檢測E-cadherin、α-SMA、磷酸化MYPT-1 具體如下：蛋白提取全程冰上操作，PBS沖洗6孔板3～4遍，為檢測E-cadherin、α-SMA、直接加入裂解液50 μL/孔[裂解液配制：碧云天RIPA全蛋白裂解液1 mL中加入磷酸酯酶抑制劑(PMSF)10 μL]。為檢測磷酸化MYPT-1蛋白，直接加入裂解液50 μL/孔(裂解液配制：碧云天RIPA全蛋白裂解液1 mL中加入磷酸化/去磷酸化磷酸酶保護劑10 μL)。之后冰上裂解15 min，刮取裂解物并收集，4°離心25 min，取上清液，收集上清液，考馬斯亮藍法測蛋白濃度，然后應用1倍sample buffer進行蛋白變性，取400 μg蛋白上樣行SDS凝膠電泳。硝酸纖維素膜轉膜后，膜置入TBS緩沖液中1 min，之后用含10%脫脂奶粉的TBS液封閉非特異抗體90 min，取出PVDF膜，用0.l%TBS-tween緩沖液,洗3次，每次5 min，然后分別加入TPBs-tween緩沖液稀釋的兔抗人E-cadherin抗體(1∶200)、鼠抗人α-SMA抗體(1∶200)、鼠抗人磷酸化MYPT-1抗體(1∶400)室溫孵育過夜9 h左右，用0.1%TPBS-tween緩沖液洗3次，每次5 min，然后分別加入用TPBS-tween緩沖液稀釋的辣根酶標記的羊抗兔二抗(1∶2 000)、兔抗鼠二抗(1∶2 000)抗體，室溫孵育2 h后用0.1%TPBS-tween緩沖液洗3次，每次10 min，然后加入ECL或ECLPluS暗室曝光，直到得到清晰條帶為止。

用 NIH1.61圖像分析軟件分別測定目的蛋白條帶密度并進行定量分析。以GAPDH為內參照，用目的蛋白與GAPDH條帶密度的比值表示每個樣本的相對蛋白表達水平。

1.2.4 real-time PCR法檢測E-cadherin、α-SMA mRNA 表達水平 美國Medline國立圖書館基因庫檢索基因，PCR引物設計在primer 5.0引物設計輔助軟件上進行，美國Invitrogen生物技術有限公司合成。提取腎組織總RNA,取2 μg RNA進行逆轉錄合成cDNA，然后采用 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Takara)基因表達測定試劑盒在ABI

Prism 7 000序列檢測系統(Applied Biosystems,Foster City,CA)進行real-time PCR 分析。變性95 ℃ 30 s，擴增95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個循環。以GAPDH作為內參照，分別計算目的基因與GAPDH 的比值。各靶基因引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2 結果

2.1 ALD作用不同時間對E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA表達的影響 研究表明，ALD濃度為10-7M，更接近CKD 3期患者的ALD濃度。所以選擇10-7mol/L ALD作為工作濃度。分別給予不同的時間干預(0、12、24、48 h)。HK2細胞在ALD作用下，隨作用時間的延長，E-cadherin蛋白及mRNA表達明顯減少，α-SMA蛋白及mRNA表達明顯增加(見圖1)，提示呈時間依賴性。本實驗選擇作用時間48 h。

圖1 不同時間點10-7M ALD作用下E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA的表達

2.2 不同組間E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA表達 與對照組比較，10-7M ALD作用下，E-cadherin蛋白及mRNA表達明顯減少，α-SMA蛋白及mRNA表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，說明醛固酮誘導HK2細胞發生EMT；與醛固酮組比較，螺內酯及Y-27632組均能顯著減少E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA表達變化，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 不同組間磷酸化MYPT-1蛋白的表達 MYPT-1是Rho激酶的作用底物，其磷酸化水平代表Rho激酶的活性。與對照組比較，ALD組磷酸化MYPT-1表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與醛固酮組比較，螺內酯及Y-27632組細胞磷酸化MYPT-1表達明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

ALD是調節機體水鹽代謝的主要皮質激素，既往認為其生物學作用主要為促進腎臟遠曲小管和集合管重吸收鈉和水，排出鉀。但許多研究表明醛固酮與腎臟纖維化關系密切,近年來發現，慢性腎臟病患者腎臟局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統異常活化，ACEI/ARB長期治療可在一定程度上延緩腎功能的進展。但是在某些患者會出現“ALD逃逸”現象，影響ACEI/ARB療效。而應用MR拮抗劑螺內酯或依普利酮能進一步減少蛋白尿，保護腎小管間質，延緩腎功能進展，由此表明ALD是一個獨立的CKD進展的危險因素[8]。

圖2 不同組間E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA表達

圖3 不同組間磷酸化MYPT-1蛋白的表達

本實驗結果顯示，體外培養人HK2細胞，在濃度10-7M的ALD作用下，隨著作用時間的延長，腎小管上皮細胞標志物E-cadherin mRNA和蛋白表達均明顯減少，而肌成纖維細胞標志物α-SMA mRNA和蛋白表達明顯增高，且呈時間依賴，說明ALD能在體外誘導HK2細胞發生EMT。此結果與既往的研究結果一致[9-10]，同時也進一步證明了之前的在體研究應用ALD灌注大鼠，大鼠的腎小管上皮細胞大量表達α-SMA，導致腎小管間質纖維化的研究結果。而應用MR拮抗劑 Spi，能明顯抑制ALD作用后HK2細胞E-cadherin、α-SMA蛋白及mRNA表達的變化，說明ALD誘導EMT可能通過與HK2細胞上的鹽皮質激素受體起作用?？赡艿臋C制為ALD與胞質內的MR 結成“ALD-受體”復合物，并移入胞核與反應元件結合，激活或抑制目的基因轉錄，減少上皮細胞極性標志蛋白E-cadherin的表達，上調轉分化標志蛋白α-SMA的表達，促進EMT的發生。Spi作為 MR拮抗劑可與MR競爭結合，減少α-SMA的表達，上調E-cadherin 的表達，抑制EMT的發生，起到腎臟保護作用，但其確切的機制有待進一步探討。

Rho/Rho激酶通路存在于大多數細胞中，是參與細胞有絲分裂、粘附、細胞骨架調整、細胞收縮、腫瘤細胞浸潤等一系列細胞生命現象的重要酶。Rho激酶的經典底物是MYPT-1，也是最早發現的天然底物。Rho激酶活化后，催化其肌球蛋白結合亞單位(MYPT-1)磷酸化，使肌球蛋白磷酸酶失活;失活的肌球蛋白磷酸酶不能將肌球蛋白輕鏈去磷酸化，使得胞漿內磷酸化的肌球蛋白輕鏈水平上升，肌動、肌球蛋白交聯增加，促進應力纖維和粘附斑的形成，調節肌動蛋白細胞骨架F-actin聚合。F-actin是參與細胞運動的主要蛋白質分子，因而也認為Rho激酶是調節細胞運動的重要激酶之一。很可能Rho激酶激活通過改變HK2細胞骨架蛋白F-actin 的重排，因而獲得肌成纖維細胞的表型而促進 EMT的發生[11]。目前無論糖尿病腎病或腎小管間質纖維化的動物模型都顯示，Rho/Rho激酶通路激活參與腎小管間質纖維化[12-13]，而且細胞學研究也證明，Rho激酶不僅介導系膜細胞發生EMT，而且也介導腎小管上皮細胞發生EMT[10,14]。因此Rho/Rho激酶可能是導致EMT并最終至臟器纖維化的重要通路。筆者之前研究發現，在大鼠持續泵入ALD后，大鼠腎小管上皮細胞表達α-SMA增多，同時伴有Rho激酶的激活。本研究亦發現，在ALD誘導HK2細胞發生EMT的同時，伴有Rho激酶活性的標志物磷酸化MYPT-1蛋白表達增多。Spi及Rho激酶抑制劑Y-27632能減少磷酸化MYPT-1表達，同時HK2細胞EMT改變減輕。這提示Rho激酶激活參與ALD誘導的HK2細胞的EMT，與Wei等[10]結果一致，也進一步證實了先期研究Rho/Rho激酶參與介導醛固酮腎臟損傷的研究成果，但是也有報道，ALD很可能通過激活HK2細胞線粒體的氧化反應參與HK2細胞EMT[9-10]。因此，進一步研究希望通過轉染Rho激酶siRNA 敲除或減少HK2細胞Rho激酶表達，觀察ALD能否誘導細胞發生EMT，為ALD誘導HK2細胞發生EMT的機制研究提供新的靶點和依據。

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Rho-kinase involved in the EMT induced by aldosterone in human proximal tubular epithelial cells

SUN Guang-ping1，ZHU Kai2，LI De-tian1*

(1.Department of Nephrology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China ;2.Department of Nephrology,General Hospital of Fushun Minining Bureau,Fushun 113000,China)

Objective To investigate whether aldosterone (ALD) can induce EMT in the human proximal tubular epithelial cell- HK2cells and the role of Rho-kinase in the process.Methods HK2cells were simultaneously cultured with serum-free DMEM/F-12 for 24 h.Then the cells were divided into the following four groups: control group(only DMEM/F-12),ALD group (ALD 10-7M),ALD+spironolactone group (ALD 10-7M and preincubation with spironolactone 10-7M) and ALD+Y27632 group (ALD 10-7M and preincubation with Y-27632 10-6M).The protein and mRNA expressions of E-cadherin and α-SMA,both with the phosphoralation of MYPT-1 were compared among the groups by real-time PCR and/or Western blot.Results Stimulation with aldosterone significantly decreased the expressions of E-cadherin protein and mRNA and increased the expressions of α-SMA protein and mRNA,which suggested EMT in the HK2cells.The phosphorated-MYPT-1 protein,marker of Rho-kinase activity simultaneously increased markedly.Preincubation with spironolactone(10-7M) or a Rho-kinase inhibitor Y-27632 (10-6M)attenuated the aldosterone-induced increase in MYPT-1 phosphorylation,accompanied by attenuation of EMT.Conclusion Activation of Rho-kinase is involved in the EMT of HK2cells induced by ALD stimulation.

Aldosterone;EMT;Rho-kinase;HK2cells

2014-11-31

1.中國醫科大學附屬盛京醫院腎內科，沈陽

110004；2.撫順礦務局總醫院腎內科，撫順 113000

遼寧省博士啟動基金(20101143)

10.14053/j.cnki.ppcr.201508009

*通信作者